第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础

内容

一、概述

二、限制性内切核酸酶

三、DNA连接酶

四、其他工具酶

一、概述

工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

工具酶名称主要功能

限制性内切核酸酶在DNA分子内部的特异性的

restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割

DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段

DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体

DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性

多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的

DNA polymerase kinease 5’-OH末端上

(接下表格)

工具酶名称主要功能

反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链

reverse transcriptase

DNA末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3’-OH DNA terminal transferase 末端或DNA的3’-末端标记dNTP

碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团

BAP orCIAP

核酸外切酶III 降解DNA3’-OH末端的核苷酸残基

exonuclease III

降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或nuclease S1寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链

工具酶名称主要功能

核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，nuclease Bal31

Taq DNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从5’→3’方向合成新生的互补链

核糖核酸酶专一性降解RNA

RNase

脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase

二、限制性内切核酸酶

1、限制性核酸内切酶的分类

2、限制性核酸内切酶的命名原则

3、限制性核酸内切酶的基本特征

4、影响限制性内切酶的活性因素

5、限制性核酸内切酶的应用

1、限制性核酸内切酶的分类

限制性核酸内切酶主要分成三大类：

I类：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。这类酶如Eco b、Eco k等。

----G AATTC----

----CTTAA G----

II类：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

----G AATTC----

----CTTAA G----

III类：有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。这类酶如Eco P I、Hin f III等。

----******----

----******----

限制内切核酸酶的识别序列特点I和III型酶识别序列特点：

一般只具有内切酶和甲基化酶的活性； 且识别位点的不恒定等；

不具备用来做工具酶。

限制内切核酸酶的识别序列特点

II型酶识别序列特点：

均有严格的识别特定核苷酸的序列；

识别的核苷酸序列一般在4－8个碱基对； 大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式。

限制性核酸内切酶的命名现在采用的是1973年由Smith H.O.和Nathans D.提议的命名系统，限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。

现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属

名的第一个字母，第二、三个字是细菌种名

的前二个字母，这些字母都用斜体字母；接

下去是细菌株的第一个字母，用正体字母书

写。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字I、II、III等来代表。

限制性内切核酸酶的命名

Eco RI

表示大肠杆菌属名第一个字母E ：表示种名头两个字母co ：表示株名

R ：表示该菌中第一个被分离出来的酶。

I ：名称

属名(大写)种名(小写）株名序数来源菌株EcoR I E co R I Escherichia coli R Hind III

H in d III Haemaphilus influenzae Hind II

H in d II Haemaphilus influenzae Hind I H in d I Haemaphilus parainfluenzae

Lurva 和Human （1952）以及Bertani 和Weigle （1953）发现了噬菌体λ的限制作用，即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞中生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的DNA 受到后一种宿主的“限制”。由此发现了限制-修饰系统。3、限制性内切核酸酶的基本特征

由宿主控制的限制与修饰作用

50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象

λ(B )

λ(K )

大肠杆菌B 大肠杆菌K

1

1

4×10 —4

10 —4 E.O.P 成斑率

efficiency of plating