第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础
内容
一、概述
二、限制性内切核酸酶
三、DNA连接酶
四、其他工具酶
一、概述
工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

工具酶名称主要功能
限制性内切核酸酶在DNA分子内部的特异性的
restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割
DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段
DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体
DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性
多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的
DNA polymerase kinease 5’-OH末端上
(接下表格)
工具酶名称主要功能
反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
reverse transcriptase
DNA末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3’-OH DNA terminal transferase 末端或DNA的3’-末端标记dNTP
碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团
BAP orCIAP
核酸外切酶III 降解DNA3’-OH末端的核苷酸残基
exonuclease III
降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或nuclease S1寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链
工具酶名称主要功能
核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，nuclease Bal31
Taq DNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从5’→3’方向合成新生的互补链
核糖核酸酶专一性降解RNA
RNase
脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase
二、限制性内切核酸酶
1、限制性核酸内切酶的分类
2、限制性核酸内切酶的命名原则
3、限制性核酸内切酶的基本特征
4、影响限制性内切酶的活性因素
5、限制性核酸内切酶的应用
1、限制性核酸内切酶的分类
限制性核酸内切酶主要分成三大类：
I类：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。

这类酶如Eco b、Eco k等。

----G AATTC----
----CTTAA G----
II类：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。

这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

----G AATTC----
----CTTAA G----
III类：有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。

它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。

这类酶如Eco P I、Hin f III等。

----******----
----******----
限制内切核酸酶的识别序列特点I和III型酶识别序列特点：
一般只具有内切酶和甲基化酶的活性； 且识别位点的不恒定等；
不具备用来做工具酶。

限制内切核酸酶的识别序列特点
II型酶识别序列特点：
均有严格的识别特定核苷酸的序列；
识别的核苷酸序列一般在4－8个碱基对； 大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式。

限制性核酸内切酶的命名现在采用的是1973年由Smith H.O.和Nathans D.提议的命名系统，限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。

现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属
名的第一个字母，第二、三个字是细菌种名
的前二个字母，这些字母都用斜体字母；接
下去是细菌株的第一个字母，用正体字母书
写。

如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字I、II、III等来代表。

限制性内切核酸酶的命名
Eco RI
表示大肠杆菌属名第一个字母E ：表示种名头两个字母co ：表示株名
R ：表示该菌中第一个被分离出来的酶。

I ：名称
属名(大写)种名(小写）株名序数来源菌株EcoR I E co R I Escherichia coli R Hind III
H in d III Haemaphilus influenzae Hind II
H in d II Haemaphilus influenzae Hind I H in d I Haemaphilus parainfluenzae
Lurva 和Human （1952）以及Bertani 和Weigle （1953）发现了噬菌体λ的限制作用，即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞中生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的DNA 受到后一种宿主的“限制”。

由此发现了限制-修饰系统。

3、限制性内切核酸酶的基本特征
由宿主控制的限制与修饰作用
50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象
λ(B )
λ(K )
大肠杆菌B 大肠杆菌K
1
1
4×10 —4
10 —4 E.O.P 成斑率
efficiency of plating
3、限制性内切核酸酶的基本特征
由宿主控制的限制与修饰作用
限制和修饰系统中的限制作用即指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制；而寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。

II型限制性核酸内切酶
种类：从各种不同的微生物中已经分离到的第二型限制性核酸内切酶就有2300多种以上。

识别序列：可以识别230种以上的DNA序列。

应用：这些发现与开发的II类限制性核酸内切酶都已成为生物技术应用中的重要工具酶。

II型酶识别序列特点
绝大多数的II型限制性核酸内切酶都有严格的识别特定核苷酸的序列。

识别的核苷酸序列一般在4～8个碱基对，最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。

大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。

II型酶识别序列特点----G AATTC----
----CTTAA G----
EcoR I 识别的核苷酸序列
（1）在对称轴5 '侧切割产生5 '粘端5 '----NG ↓AATTCN----3'
Eco RI 5'----NG AATTCN----3'3'----NCTTAA ↑GN----5'3'----NCTTAA GN----5'（2）在对称轴的3 '侧切割产生3 '粘端
5 '----NCTGCA ↓GN----3'
Pst I 5'----NCTGCA GN----3'3'----NG ↑ACGTCN----5'3'----NG ACGTCN----5'
+
++
（3）在对称轴处切割产生平末端
5 '----NCCC ↓GGGN----3'Sma I 5'----NCCC GGGN----3'
+ 3'----NGGG ↑CCCN----5'3'----NGGG CCCN----5'
有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。

但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。

5'----A
3'----TCTAG GATCC----3'
G----5'
5'----A GATCT----3' 3'----TCTAG A----5'5'----G GATCC----3' 3'----CCTAG G----5'
Bgl II Bam H I 5'----AGATCC----3'
3'----TCTAGG----5'
同裂酶（isoschizomers）
通常将能切割同一靶序列的限制性核酸内切酶称为同裂酶。

同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。

如Hpa II和Msp I。

5'----C CGG----3'
3'----GGC C----5'
（star activity）
在某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性则称为星号活性。

（star activity）
实例：Eco R I在正常情况下，识别6个核苷酸顺序GAATTC，但在异常情况下，可识别4个核苷酸的顺序AATT，酶切产物能电泳鉴定出现的DNA条带数比正常情况下有增加。

产生星号活性的因素:
甘油浓度过高。

在限制性内切酶的浓度与DNA数量的比值为50 U/μg DNA时，甘油的含量为7.5%（v/v）便能引起星号活性。

当应用酶浓度与DNA数量的比值为10 U/μg DNA时，甘油含量高于15%（v/v）或以上也会引起星号反应。

离子强度不适合。

产生星号活性的因素:
阳性离子的变化。

如将反应体系中Mg2+改为Mn2+时可促使Eco R I、Hin d III产生星号反应。

溶液中pH的变化。

如用Eco R I酶解时，反应体系中的pH值由pH2.5升高到pH8.5时也会出
现星号反应。

有机溶剂残留的影响。

生物体内DNA的甲基化现象：
原核细菌胞内DNA通常只有2-10％是甲基化(发生在识别顺序的腺嘌呤N-6位上或胞嘧啶第五位残基上)
真核生物只有胞嘧啶可能被甲基化(已经发现真核细胞中的甲基化作用与转录作用的调节、细胞分化、染色体结构、DNA修复和DNA重组等多种功能有关)。

研究甲基化作用的工具：
限制性核酸内切酶可作为研究甲基化作用的工具，检测在特定基因或遗传结构有关的片段内发生甲基化作用的状况(如Hpa II只能分解未甲基化的CCGG顺序，但Msp I对已甲基化和未甲基化的CCGG都能进行酶解，因此根据这两种酶切结果，便能确定DNA中甲基化胞嘧啶的数量和位置) 。

限制性内切酶对DNA甲基化研究的实例:研究腺嘌呤的甲基化作用：
可用Sau3AL, Dpn I和Mbo I 等三种酶分别酶切
进行比较(因为Sau3AI可以酶解GATC和
G Me ATC (表示腺嘌呤核苷酸甲基化)两种识别
顺序，而Dpn I只能分解G Me ATC顺序，Mbo I
仅分解GATC顺序)。

限制内切核酸酶活性的检测方法
粗放法: 早期测定是根据酶切DNA后DNA溶液的粘度变化来确定酶的活性。

精确法：酶的活性的检测通过比较酶降解DNA 片段的程度精确的进行定量。

限制性内切酶的活性高低通常以活性单位表示。

限制内切核酸酶活性的检测方法
酶单位的定义：不同的厂商略有不同，现在常见的限制性内切酶的活性单位是1微克的纯DNA(一般用λDNA为基质)在指定的缓冲体系中，指定温度酶解60分钟完全时酶切所需限制性内切酶的活力量，定义为一个酶单位。

4、影响限制性内切酶的活性因素 DNA基质的纯度和物理特征
缓冲液
反应体积
反应温度与保温时间
酶反应的终止
DNA基质的纯度和物理特征的影响
DNA纯度：限制核酸内切酶酶解DNA的效率很大程度上取决于DNA本身的纯度。

纯度较差的DNA在正常的酶切时，可适当做如下补救： 适当增加限制性核酸内切酶的量，每微克DNA基质由1单位提高到5-10倍。

适当扩大反应体积，以让污染物相应得到稀释。

适当延长酶解的反应时间，但DNase污染不能用此法。

如RNA过多可在反应体系中加入适量的RNase。

DNA的分子结构对酶切效率的影响
DNA分子结构：DNA的分子结构也影响酶切的效率。

例如：Hae III, Eco RI, Msp I和Hin dIII需要酶切位点呈双链状态，并且至少两圈双螺旋结构。

虽然有酶能分解单链DNA，但是酶切位点仍然呈双链结构。

超螺旋DNA：其完全酶解所需要的酶量要比已经酶切成线性DNA的高。

有的酶切割同一DNA的不同位点，其效率也有差别，这一特性对于DNA（有的甚至高出20倍）的部分酶切非常重要。

两种甲基化酶------dam和dcm
Dam：催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化。

dcm ：催化CCA/TGG序列中内部胞嘧啶残基甲基化。

限制性核酸内切酶反应对使用的缓冲液要求有较高的质量
防污染：缓冲液中应避免重金属离子及各种核酸酶的污染，过滤除菌。

浓液冻存：标准缓冲液一般都配成10倍浓度，冰冻状态贮存。

限制性核酸内切酶反应对使用的缓冲液要求有较高的质量
主要组分：其主要组分有MgCl、NaCl、KCl、Tris-HCl、硫基试剂，如β-硫基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）或明胶等。

三种缓冲液：根据酶的特性制备成相应的缓冲液，通常情况下多采用低、中、高盐三种缓冲液。

维持pH：缓冲液中Tris-HCl的作用是确保反应体系中的pH维持在酶活性所需的最佳范围
内。

常用的缓冲液pH在7-8之间，多为
pH=7.4左右。

大多数限制性核酸内切酶
对pH的适应能力较大，但也有些酶对pH
较敏感，如Eco RI pH=7.2到8.5时，酶的
活性就显著下降。

缓冲液pH：影响缓冲液pH的因素有：①当温度变化10℃时，Tri-HCl的pH大约改变0.3个
单位。

②蒸馏水偏酸性，稀释体系有时
会降低pH。

二价阳离子
多数使用Mg2＋，有时也可用Mn2＋代替，但是对Eco RI、Hin dIII、Hae III、Bam HI等，用Mn2＋代替便可能出现星号反应。

单价阳离子
对酶反应亦有刺激作用。

如Spn I、Mlu I等在50-100mM NaCl 或KCl时会被激活，而另一些酶如Hind II、Fnu Dl在上述离子强度>20mmol/L将显著受到抑制。

巯基试剂
缓冲液中的硫基试剂对酶起稳定作用和防止酶失活，但并不是所有的酶都需要这类试剂，如有的硫基试剂对Ava I、Bam HI、Pvu I及Sma I等的酶活性反而有抑制作用。

牛血清白蛋白（BSA）或明胶
对酶起保护作用
防止分解和吸附可以防止蛋白酶的分解和非特异性吸附等。

减轻某些酶变性能减轻某些有害环境因素如加热、表面张力及化学因素引起的酶变性作用。

在酶的保存液中或酶活性不够稳定或长时间的酶反应体系中都加定量的BSA。

但是由于BSA会与DNA结合，在电泳时会出现条带模糊的拖尾现象。

遇有这种情况在电泳前可加入适量的SDS，并置65℃5分钟后点样，可以消除BSA的影响。

反应体积的影响主要有如下两个方面：
商品化的酶类保存液含有50%的甘油，反应体系中甘油浓度过高会影响酶切效果，甘油的含量超过5%会抑制酶的活性。

一般加酶的体积应小于总体积的1/10。

当酶切反应体积小于10μl时，由于酶有一定的粘度，难以做到精确取酶，往往造成酶量不足或过量。

因此最好将高浓度的酶溶液进行适当稀释。

另外由于小体积的酶切反应会造成水份的蒸发至盖上，造成反应体系内各成份浓度发生变化而影响酶切效果。

反应温度与保温时间对酶活性的影响反应温度：
不同的限制性内切酶具有不同的最适酶切反应温度，大多数的酶反应温度为37℃。

列外的如Sma I、Apa I、Apy I是30℃，Mae I是45℃，Bcl I 50℃，
Mea III 55℃，EII60℃，Taq I 65℃等；又如Eco RI 42℃以上便钝化，而Hae II在70℃仍能保持活性。