猪链球菌II型检验方法pdf

ＩＩ型猪链球菌检测方法介绍　
自1968年国际上首次报道猪2型链球菌引起人类严重感染病例后，至1989年，国外共报告了108例猪2型链球菌所致人类感染的病例，1994年、1997年及1999年国外又相继有该菌引致人类严重感染及死亡病例的报道。

我国1990年在广东省首次发现猪群中有类似II型链球菌病，但未见人间感染发病。

1998年~1999年，在江苏省和浙江省部分县(市)，先后两次爆发了猪急性败血症。

共有上万头猪发病，同时还传染给从业人员几十人，发生脑膜炎、关节炎及中毒性出血性休克征病例，病人出现多脏器功能损害，并先后从病人和病猪中分离出猪链球菌菌株，经鉴定为猪II型链球菌，人源株与猪源株为同源性。

2005年6月下旬，四川省资阳、内江等地区有近80例患者急性发病，出现中毒性休克、DIC、脑膜炎，有12例重症患者死亡，经鉴定为猪II型链球菌感染。

目前，该菌已成为我国当前引起人兽共患病的一种重要的新病原菌。

猪链球菌归类于链球菌属，菌体呈卵圆形，短链状排列，革兰染色阳性，兼性厌氧，在羊血平板上呈α溶血，部分在马血平板上呈β溶血，菌落细小。

引起人和猪发病的猪链球菌以Lancefield血清群R群血清型2型为主，溶菌酶释放蛋白（MRP）和细胞外蛋白因子（EF）是两种重要的毒力因子。

猪链球菌病是一种人畜共患的急性、热性传染病。

人与病猪密切接触或食用未煮熟的病猪肉制品时猪链球菌可通过人体伤口、消化道等途径传染给人，出现脑膜炎、关节炎、持久性听力缺失，严重者可导致中毒休克综合征并引起死亡。

早期临床诊断疑为：炭疽病、流行性出血热、钩体病、链球菌引起的猪肺疫及O157:H7出血性大肠杆菌等细菌性病原体引起的疾病。

因此病原体的分离和鉴定对疾病的确诊、预防和控制十分重要，本文简单介绍猪链球菌II型的检验程序。

一、病原分离
1、可采集病人的血，腹水，脑脊液或者是尸检标本；病、死猪的肝脏、脾脏、腹水、心血，4℃保存。

2、制作肝脏、脾脏的触片，或用腹水、血液、脑脊液涂片，火焰固定后进行革兰染色，油镜下观察是否有成对或短链状革兰阳性球菌。

3、将标本接种于选择增菌培养液（含15 μg /ml多粘菌素B，30 μg /ml萘啶酮酸的脑心培养基），或直接划线接种于含两种抗生素的羊血琼脂平板，置于5％CO2培养箱或蜡烛缸中37℃培养。

二、生化反应
1、普通实验室可以重点做V-P试验,七叶苷水解试验，6.5%的氯化钠生长试验，45℃﹑10℃生长试验，胆汁耐受试验（麦康凯培养基）。

如结果依次为阴性、阳性、阴性、阴性、阴性、阴性，可初步判定为猪链球菌。

同时送相关实验室做进一步鉴定。

具有参考价值的鉴定项目有：
1）生长特性
10℃45℃ 6.5%NaCl PH9.6 麦康凯培养基
不生长不生长不生长不生长不生长
2）生化试验
V-P 马尿酸盐甘露醇甘露糖山梨醇阿拉伯糖核糖———————
七叶苷乳糖精氨酸葡糖海藻糖棉子糖淀粉＋＋＋＋＋＋＋
2、可用市售的产品化的鉴定系统进行鉴定。

例如，API生化鉴定系统的API-strep手工鉴定条可鉴定到种，复星佰珞BioFosun微生物鉴定系统可直接鉴定到血清型。

三、药敏试验
根据NCCLS琼脂稀释法、或药敏纸片法的操作要求进行。

四、血清学检测
1、用兰氏分型乳胶凝集链球菌试剂盒进行分群。

2、用猪链球菌35个分型血清进行分型：
取一滴猪链球菌诊断血清悬滴于载玻片上，与一滴菌悬液充分混合，或用接种环（牙签也可）刮取单个菌落直接与血清混合，观察是否出现凝集反应，同时用生理盐水做对照。

五、分子生物学鉴定（PCR检测和序列分析）
提取增菌液中的细菌基因组DNA，或挑取血平板上的可疑菌落，进行PCR检测。

取5μl 扩增产物在1-2℅的琼脂糖凝胶中进行电泳，观察结果。

附：猪链球菌II型检测操作流程图
说明：检验过程中涉及样品和活菌的操作需严格注意生物安全。

病人或动物检样
（血液、脑脊液，腹水、实质脏器等）
血清学检测
革兰氏染色
（见G +成对球菌、短链或长链球菌）。