基因克隆及克隆基因的表达

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三、目的DNA与载体连接（接）
T4DNA ligase

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四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）
宿主细胞
感受态细胞（competent cell）：
处于易于接纳外源物质的状态的细菌

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几个相关概念：
Lac I
Prokaryotic Expression Plasmid
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一、原核宿主细胞 大肠杆菌（E.coli)
优点：简便, 快速、成本低 可高密度发酵培养 20-30min
注意：
12 hours Once 用来克隆基因和表达基因的菌株不一样， the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.
T-载体：
T7
pMD18-T 2692bp
HindIII Spln PstI HincII AccI SalI
T
T
Xbal BamHI SmaI XmaI KpnI SacI EcoRI
LOGO Sp6
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
速高效表达基因产物。
真核表达系统： 外源基因引入真核细胞，使外源
基因在真核细胞中表达。

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第一部分.外源基因在原核细胞中的表达
原核细胞表达 系统组成
一、原核宿主细胞 二、原核表达载体
Recombinant Protein
wΒιβλιοθήκη
转化（transformation） 质粒或黏粒→细菌 质粒→酵母（真核细胞） 转染（transfection） 外源DNA→真核细胞（酵母除外） 感染（infection） 噬菌体颗粒→细菌 病毒颗粒→哺乳细胞

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将重组DNA转入受体细胞的常用方法：
化学法：
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5

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PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
（2）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） 单链闭合环状DNA分子
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克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类 3.穿梭载体(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用
人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类 宿主细胞中复制、扩增。
Recombinant vector
Proteins
原核表达系统
Prokaryotic expression system
真核表达系统
Eukaryotic expression system
大肠杆菌
酵母
昆虫 细胞
哺乳动物 细胞

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表达体系
原核表达系统： 外源基因引入原核细胞，使其快
1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子
细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：
无载体转入的细胞——dead；含有载体的细胞——alive。
尚需进一步鉴定载体是否为含有目的DNA的重组载体

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五、重组体的筛选与鉴定（筛）
2. 蓝白筛选
Blue-white screening of recombinants
例如，既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。 这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真 核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。 通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表达分析。

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表达载体用于外源DNA的表达
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（一）克隆载体（cloning vector）应具备的主要特点 1.至少有一个复制起点（origin of replication, ori） 2.至少有一个选择性标志（selection marker）
3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）
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基因克隆、 克隆基因的表达
吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室 讲师
孙 巍
Tel: 0431 - 85619369
2012-10
一、目的DNA的分离获取（分）
分离获取目的DNA有多种方法：
(一) PCR——待扩增目的基因两端序列法——直接合成目的DNA（序列已知、片段较短）如何从中钓取基因？LOGO
PCR的基本原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 DNA 一个细胞只接受一个 重组DNA分子
单克隆
LOGO基因组DNA（genomic DNA library）： 包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克
隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息。
（二）考虑目的DNA的大小及受体细胞的种类和来源
载体 质粒 λ 噬菌体载体 黏粒 BAC YAC 插入DNA片段 <5~10 kb ~ 20 kb ~50 kb ~400 kb ~3Mb 宿主细胞 细菌，酵母 细菌 细菌 细菌 酵母

（三）含有合适的MCS
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最常用。 原核表达质粒
噬菌体：长片段

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1、原核表达质粒的元件：
Prokaryotic promoter start piont
PT7
SD
MCS
Terminator
复制原点 克隆元件： 插入位点 筛选标记 强启动子 表达元件： 终止子 SD序列
Ampicillin resistance
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点

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二、载体的选择与准备（择）；
载体（vector）：携带外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中 的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
分类：
1.按功能
克隆载体（cloning vector） 表达载体（expression vector）
——在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法
Lac Operon ?
诱导物
IPTG
β半乳糖苷酶

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五、重组体的筛选与鉴定（筛）
3. 限制性内切酶法：根据限制酶切图谱筛选特定DNA
提取阳性克隆的重组DNA
RE消化
NcoI HindIII
300bp
2700bp
表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。
Recombinant insulin
6-8 Billion bacteria LOGO

原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：
①生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表 达产物。
②基因组结构简单，便于基因操作和分析。
电泳
有无DNA片段的插入； 插入片段的大小
M
空质粒 重组质粒
Linear vector (2700bp)
连接前用什么酶， 就用什么酶切
insert (300bp)

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五、重组体的筛选与鉴定（筛）
4. PCR法：直接鉴定目的DNA的存在
利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。 如利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，能
表达载体（expression vector）：用来在宿主细胞 中表达外源基因的载体
依据其宿主细胞的不同可分为:
原核表达载体（prokaryotic expression vector） 真核表达载体（eukaryotic expression vector）

可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。
5. 核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的DNA的方法
可明确序列和阅读框的正确性

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基因克隆技术是分子生物学的核心技术
•人源抗体 •重组多肽药物 •重组疫苗 DNA序列测定
重组蛋白
基因突变
核酸探针标记
基因克隆技术
③多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的 表达载体。
④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 ⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空 间构象。 ⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳 定性。

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二、原核表达载体
在原核细胞中表达外源基因的载体。 质粒： 最方便，
质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等
2.按基本元件 的来源

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二、载体的选择与准备（择）；
（一）根据DNA克隆的目的选择与准备适宜载体
1. 获得目的DNA片段——选用克隆载体； 2. 获得目的DNA片段所编码的蛋白质——选用表达载体。
会赋予宿主细胞一些遗传性状
质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。

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目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳 10kb以内的外源DNA 。
pUC18/19质粒图谱
pUC18/19质粒，2686bp，是最常用的质粒载体
缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达 500-700 LOGO
—获取重组蛋白
重组子
目的基因的 mRNA
表达蛋白质

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亚克隆（Sub cloning）
克隆载体
表达载体

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Target gene promoter
转化宿主细胞 Transformation/ Transfection
4.应有较高的拷贝数
pBR322质粒图谱

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克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
1.质粒(plasmid)是最常用的克隆载体
广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中 独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构 能在宿主细胞内独立自主复制 带有某些遗传信息,
分子杂交
基因合成
PCR-克隆-亚克隆•基因组 •cDNA RNAi重组载体
•Southern blot •Northern blot •基因治疗载体 •RNA转录载型
转基因动物模型

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克 隆 基 因 的 表 达
2.噬菌体(phage)
能感染细菌的病毒 线性双链DNA分子
（1）λ噬菌体DNA改造系统
cos位点:两端各有一条由12个碱基组成、彼此完全互补且5’突出的序 列
插入型：λgt系列，适用于cDNA克隆
置换型：EMBL系列，适用于基因组 DNA克隆 48500bp
cos 12bp Long (left) arm 12bp cos Nonessential portion Short (right) for replication arm
氯化钙法 物理法： 电击法 显微注射法 等

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五、重组体的筛选与鉴定（筛） 主要方法：
1. 抗生素抗性筛选 2. 蓝白筛选 3. 限制性内切酶法 4. PCR法 5. DNA测序法

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五、重组体的筛选与鉴定（筛）