堆肥化过程中微生物群落的动态
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粪、 切碎成 5 cm 左右的麦秸、 牛粪按1!3!6质量比例均 匀混合, 使 C N 为 25~ 30, 水分含量在 55%~ 60% . 堆制试验是在自建的水泥发酵槽内进行. 在宽 1 5 m, 深 1 0 m, 长 20 m 的发酵槽内堆成上部 长 2 m、 下部长 3 m、 高 1 m 的堆体 . 堆体温度上升到 50 ∀ 开始人工翻堆, 高温期每 2 d 翻堆 1 次, 温度下降到 35 ∀ 后每 5 d 翻 1 次, 试验时间为 60 d. 每天测定堆 体的上 ( 0 2 m) 、 中 ( 0 5 m) 、 下部 ( 0 7 m) 的温度和 堆制现场的环境温度 . 1 2 堆肥化过程中微生物数量的测定方法 1 2 1 培养基 细菌分离采用牛肉膏蛋白胨培养基 , 放线菌分 离用淀粉硝酸钾培养基, 真菌分离用马丁孟加拉红 链霉素 培养基 , 培养 基的 组成 和配制 方法 见文 献 [ 13] . 1 2 2 取样及分离方法 在堆制当天 和堆制后第 3、 10、 15、 25、 35、 45 及 60 d, 从堆体的上、 中、 下部位多点取样, 混匀后一部 分样 品 用 固 定 缓 冲 液 ( 100 mmol L Tris HCl, 40 mmol L EDTA, 见参考文献 [ 4] ) - 20 ∀ 冰冻保存 , 用 于 DNA 提取 , 一部分样品用于直接平板稀释法微生 物分离培养 . 在 30 ∀ 和 55 ∀ 恒温下, 细菌、 真菌、 放 线菌在分别培养 2、 4 和 6 d, 观察记录微生物种类和 数量 . 1 3 堆肥样 品的 C N 、 木质素、 纤维素和半 纤维素 含量的测定 各个时期的样品的全碳含量采用重铬酸钾氧化 法测定 , 全氮含量测定采用凯氏法 , 半纤维素、 纤 [ 15] 维素和木质素含量的测定采用范氏洗涤法 . 1 4 堆肥样品 DNA 提取、 PCR 反应及样品中细菌 的 DNA 序列分析 1 4 1 样品 DNA 提取 DNA 提取采用文献 [ 16] 提供的氯苯法 , DNA 提
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163319; 2 中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094; 3 扬州大学环 境
摘要 : 通过变性梯度凝胶电泳 ( DGGE) 和平板计数法对堆肥化过程中 微生物的 区系动态变 化进行了 研究 . 结 果表明 , 在堆肥 化 过程中 , 微生物数量总的趋势是细菌的数量最多 , 放线菌 次之 , 真菌 的数量 最少 , 中温微 生物的 数量始 终高于 高温微生 物 . 当 发酵结束后 , 中温微生物的数量低于发酵初始水平 , 高温 放线菌 和高温真 菌的数 量试验 结束后 高于初 始水平 , 高温 细菌的 数 量在整个堆肥化过程中变化不大 . 通 过 DGGE 分析表明 , 发酵过程中细菌的种类发生了明显的更迭现象 . 发酵初期 Bdellovibrio、 Clostridia bacterium 、Bacillus 、Clostridium 等 占 优 势 , 中 期 Beta proteobacterium 、Petr obacter succinimandens 、Nitrospirae bacterium、 Clostridium 等占优 势 , 后 期 Clostridium 、 Beta proteobacterium 、 Paenibacillus 等占 优势 , 而 在整 个堆 肥 化过 程中 Clostridium 都 是 优 势种 . 关键词 : 堆肥化 ; 微生物区系 ; 变性梯度凝胶电泳
堆肥化是有机固体废弃物无害化、 减量化、 资源 化的根本途径. 因此 , 有机固体废弃物的堆肥化研究 一直是环境科学领域研究的 热点之一 . 堆肥化 过程是以微生物为主导的物理化学和生物学过程 , 是由群落结构演替迅速的多个微生物群落共同作用 而实现的动态过程 , 在该过程中的每一个微生物群 落在一定的时间内有适合自身生长繁殖的条件 , 对 [ 4] 某一种或某一类特定物质的分解起作用 . 因此, 研 究微生物区系的变化对于揭示整个堆肥化过程中的 物质转化规律、 腐熟度进程等非常重要 . 堆肥原料的 性质决定了其中微生物群体结 构的复杂性和 多样 性, 要研究微生物群落的动态变化非常困难, 主要受 到研究方法的限制 , 因为传统的微生物分离及鉴定 技术 只 能得 到 自然 状 态下 微生 物 群 落的 一 小 部
[ 1~ 3]
分 . 一些研究者主要采用以真菌、 细菌和放线菌等 分类方法进行研究堆肥过程中的微生物动态变化, 或者按照 G 菌、 G 菌、 嗜热菌、 嗜温菌、 氨化细菌、 [ 6~ 9] 硝化细菌等分类方法进行研究 , 这些方法受到 依赖纯培养的限制, 结果不够全面、 充分 , 得到的结 论也各不相同. 近年来 , 分子生态学技术被广泛应用 于环境微生物的研究中 , 得到了许多关于堆肥化过 程中微生物区系变化的直接证据, 但是在堆肥化过
中图分类号 : X172 文献标识码 : A 文章编号 : 0250 3301( 2007) 11 2591 07
Microbial Dynamics During the Composting Process
WANG Wei dong , WANG Xiao fen , PIAO Zhe , LIU Chang li , GAO Xiu zhi , CUI Zong jun
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( 1 College of Biological Science and Technology , Heilongjang August First Land Reclamation University, Daqing 163319, China; 2 College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, China; 3 College of Environmental Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China) Abstract: Microbial dynamics of microbial community during the composting process was investigated with the methods of denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE) and plating. The results showed that the most of microorganism count was bacterium, the second was actinomycete and the least was fungi. At the same time, the count of the thermophilic microorganism was always less than that of the mesophilic during the composting process. The count of mesophilic microorganism at later stage was less than that at the initial stage. However, the count of thermophilic antinomycete and fungi at later stage were more than that at initial stage, and the count of thermophilic bacterium was stable throughout the composting process. The bands pattern of DGGE and 16S rDNA analyses indicated that bacterial succession was presented during the composting process. The genera of Bdellovibrio, Clostridia bacterium and Bacillus were dominant species at initial stage ( before the first 15 days) , and Beta proteobacterium , Petrobacter succinimandens , Nitrospirae bacterium and Paenibacillus were dominant species at middle and later stage. Moreover, Clostridium was found throughout the process. Key words: composting; microbial community; denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE)
PCR 用 AmpliTaqGold 反应系统 ( Perkin Elmer, Applied Biosystems, NJ, USA) . 引物为 357F 和 517R, 在引物 357F 上加了 GC 夹子 , 357F 的序列 为 5 # CCTACGGGAGGCAGCAG 3 #, GC 夹子 的序列为 5 # CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG GGG 3 #; 引物 517R 的序列为 5# ATTACCGCGGCTGCT GG 3#. PCR 反 应程 序为: 95 ∀ 10 min, 93 ∀ 1 min, 55 ∀ 退火 1 min, 72 ∀ 延伸 5 min; 93 ∀ 0 5 min, 55 ∀ 0 5 min, 72 ∀ 2 min, 30 个循环 ; 93 ∀ 1 min, 55 ∀ 1 min, 72 ∀ 5 min. 扩增 产物 以 2% 琼 脂糖 凝胶 电泳 检测. 1 4 3 DGGE TM 使 用 Dcode Universal Mutation Detector System ( BIO RAD Laboratories, Hercules, CA, USA) . 步骤按 照 Muyzer 等
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收稿日期 : 2006 09 10; 修订日期 : 2007 05 22 基金项目 : 国家 十 一五 科技支 撑计划 项目 ( 2006BAD04A09 ) ; 黑 龙 江省博士后基金项目 ( LDH Z05009) ; 黑龙江省农垦总局 科 技攻关项目 ( HNKXIV 02 03 03) 作者简介 : 王伟东 ( 1970~ ) , 男 , 博士 , 副 教授 , 主要 研究方 向有机 废 弃物资源再利用 , E mail: wwdcyy@ sohu. com * 通讯联系人 , E mail: acuizj@ 163. com
wenku.baidu.com第 28 卷第 11 期 2007 年 11 月
环 境 科 学 ENVIRONMENTAL SCIENCE
Vol. 28, No. 11 Nov. , 2007
堆肥化过程中微生物群落的动态
王伟东 , 王小芬 , 朴哲 , 刘长莉 , 高秀芝 , 崔宗均
( 1 黑龙江八一农垦 大学生命科技学院 , 大庆 科学与工程学院 , 扬州 225009)
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环
境
科
学
28 卷
程中微生物区系是存在频繁的更替、 还是微生物群 体占据优势后不再更替等方面存在分歧
[ 4, 10~ 12]
取及后续纯化过程见参考文献[ 4] . 1 42 变性梯度凝胶电泳 ( DGGE) 所需 PCR 反应
TM
.本
研究采用传统的平板分离法与 DGGE 技术相结合 , 研究堆肥化过程中不同微生物群落的动态变化 , 揭 示堆肥化过程中微生物区系的变化规律, 为有机固 体废弃物堆肥化利用的生产实践提供理论依据和技 术支持. 1 1 1 材料与方法 堆肥体系的构建 堆肥原料采用新鲜的鸡粪、 牛粪及干枯麦秸. 将鸡
粪、 切碎成 5 cm 左右的麦秸、 牛粪按1!3!6质量比例均 匀混合, 使 C N 为 25~ 30, 水分含量在 55%~ 60% . 堆制试验是在自建的水泥发酵槽内进行. 在宽 1 5 m, 深 1 0 m, 长 20 m 的发酵槽内堆成上部 长 2 m、 下部长 3 m、 高 1 m 的堆体 . 堆体温度上升到 50 ∀ 开始人工翻堆, 高温期每 2 d 翻堆 1 次, 温度下降到 35 ∀ 后每 5 d 翻 1 次, 试验时间为 60 d. 每天测定堆 体的上 ( 0 2 m) 、 中 ( 0 5 m) 、 下部 ( 0 7 m) 的温度和 堆制现场的环境温度 . 1 2 堆肥化过程中微生物数量的测定方法 1 2 1 培养基 细菌分离采用牛肉膏蛋白胨培养基 , 放线菌分 离用淀粉硝酸钾培养基, 真菌分离用马丁孟加拉红 链霉素 培养基 , 培养 基的 组成 和配制 方法 见文 献 [ 13] . 1 2 2 取样及分离方法 在堆制当天 和堆制后第 3、 10、 15、 25、 35、 45 及 60 d, 从堆体的上、 中、 下部位多点取样, 混匀后一部 分样 品 用 固 定 缓 冲 液 ( 100 mmol L Tris HCl, 40 mmol L EDTA, 见参考文献 [ 4] ) - 20 ∀ 冰冻保存 , 用 于 DNA 提取 , 一部分样品用于直接平板稀释法微生 物分离培养 . 在 30 ∀ 和 55 ∀ 恒温下, 细菌、 真菌、 放 线菌在分别培养 2、 4 和 6 d, 观察记录微生物种类和 数量 . 1 3 堆肥样 品的 C N 、 木质素、 纤维素和半 纤维素 含量的测定 各个时期的样品的全碳含量采用重铬酸钾氧化 法测定 , 全氮含量测定采用凯氏法 , 半纤维素、 纤 [ 15] 维素和木质素含量的测定采用范氏洗涤法 . 1 4 堆肥样品 DNA 提取、 PCR 反应及样品中细菌 的 DNA 序列分析 1 4 1 样品 DNA 提取 DNA 提取采用文献 [ 16] 提供的氯苯法 , DNA 提
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163319; 2 中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094; 3 扬州大学环 境
摘要 : 通过变性梯度凝胶电泳 ( DGGE) 和平板计数法对堆肥化过程中 微生物的 区系动态变 化进行了 研究 . 结 果表明 , 在堆肥 化 过程中 , 微生物数量总的趋势是细菌的数量最多 , 放线菌 次之 , 真菌 的数量 最少 , 中温微 生物的 数量始 终高于 高温微生 物 . 当 发酵结束后 , 中温微生物的数量低于发酵初始水平 , 高温 放线菌 和高温真 菌的数 量试验 结束后 高于初 始水平 , 高温 细菌的 数 量在整个堆肥化过程中变化不大 . 通 过 DGGE 分析表明 , 发酵过程中细菌的种类发生了明显的更迭现象 . 发酵初期 Bdellovibrio、 Clostridia bacterium 、Bacillus 、Clostridium 等 占 优 势 , 中 期 Beta proteobacterium 、Petr obacter succinimandens 、Nitrospirae bacterium、 Clostridium 等占优 势 , 后 期 Clostridium 、 Beta proteobacterium 、 Paenibacillus 等占 优势 , 而 在整 个堆 肥 化过 程中 Clostridium 都 是 优 势种 . 关键词 : 堆肥化 ; 微生物区系 ; 变性梯度凝胶电泳
堆肥化是有机固体废弃物无害化、 减量化、 资源 化的根本途径. 因此 , 有机固体废弃物的堆肥化研究 一直是环境科学领域研究的 热点之一 . 堆肥化 过程是以微生物为主导的物理化学和生物学过程 , 是由群落结构演替迅速的多个微生物群落共同作用 而实现的动态过程 , 在该过程中的每一个微生物群 落在一定的时间内有适合自身生长繁殖的条件 , 对 [ 4] 某一种或某一类特定物质的分解起作用 . 因此, 研 究微生物区系的变化对于揭示整个堆肥化过程中的 物质转化规律、 腐熟度进程等非常重要 . 堆肥原料的 性质决定了其中微生物群体结 构的复杂性和 多样 性, 要研究微生物群落的动态变化非常困难, 主要受 到研究方法的限制 , 因为传统的微生物分离及鉴定 技术 只 能得 到 自然 状 态下 微生 物 群 落的 一 小 部
[ 1~ 3]
分 . 一些研究者主要采用以真菌、 细菌和放线菌等 分类方法进行研究堆肥过程中的微生物动态变化, 或者按照 G 菌、 G 菌、 嗜热菌、 嗜温菌、 氨化细菌、 [ 6~ 9] 硝化细菌等分类方法进行研究 , 这些方法受到 依赖纯培养的限制, 结果不够全面、 充分 , 得到的结 论也各不相同. 近年来 , 分子生态学技术被广泛应用 于环境微生物的研究中 , 得到了许多关于堆肥化过 程中微生物区系变化的直接证据, 但是在堆肥化过
中图分类号 : X172 文献标识码 : A 文章编号 : 0250 3301( 2007) 11 2591 07
Microbial Dynamics During the Composting Process
WANG Wei dong , WANG Xiao fen , PIAO Zhe , LIU Chang li , GAO Xiu zhi , CUI Zong jun
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( 1 College of Biological Science and Technology , Heilongjang August First Land Reclamation University, Daqing 163319, China; 2 College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, China; 3 College of Environmental Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China) Abstract: Microbial dynamics of microbial community during the composting process was investigated with the methods of denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE) and plating. The results showed that the most of microorganism count was bacterium, the second was actinomycete and the least was fungi. At the same time, the count of the thermophilic microorganism was always less than that of the mesophilic during the composting process. The count of mesophilic microorganism at later stage was less than that at the initial stage. However, the count of thermophilic antinomycete and fungi at later stage were more than that at initial stage, and the count of thermophilic bacterium was stable throughout the composting process. The bands pattern of DGGE and 16S rDNA analyses indicated that bacterial succession was presented during the composting process. The genera of Bdellovibrio, Clostridia bacterium and Bacillus were dominant species at initial stage ( before the first 15 days) , and Beta proteobacterium , Petrobacter succinimandens , Nitrospirae bacterium and Paenibacillus were dominant species at middle and later stage. Moreover, Clostridium was found throughout the process. Key words: composting; microbial community; denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE)
PCR 用 AmpliTaqGold 反应系统 ( Perkin Elmer, Applied Biosystems, NJ, USA) . 引物为 357F 和 517R, 在引物 357F 上加了 GC 夹子 , 357F 的序列 为 5 # CCTACGGGAGGCAGCAG 3 #, GC 夹子 的序列为 5 # CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG GGG 3 #; 引物 517R 的序列为 5# ATTACCGCGGCTGCT GG 3#. PCR 反 应程 序为: 95 ∀ 10 min, 93 ∀ 1 min, 55 ∀ 退火 1 min, 72 ∀ 延伸 5 min; 93 ∀ 0 5 min, 55 ∀ 0 5 min, 72 ∀ 2 min, 30 个循环 ; 93 ∀ 1 min, 55 ∀ 1 min, 72 ∀ 5 min. 扩增 产物 以 2% 琼 脂糖 凝胶 电泳 检测. 1 4 3 DGGE TM 使 用 Dcode Universal Mutation Detector System ( BIO RAD Laboratories, Hercules, CA, USA) . 步骤按 照 Muyzer 等
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收稿日期 : 2006 09 10; 修订日期 : 2007 05 22 基金项目 : 国家 十 一五 科技支 撑计划 项目 ( 2006BAD04A09 ) ; 黑 龙 江省博士后基金项目 ( LDH Z05009) ; 黑龙江省农垦总局 科 技攻关项目 ( HNKXIV 02 03 03) 作者简介 : 王伟东 ( 1970~ ) , 男 , 博士 , 副 教授 , 主要 研究方 向有机 废 弃物资源再利用 , E mail: wwdcyy@ sohu. com * 通讯联系人 , E mail: acuizj@ 163. com
wenku.baidu.com第 28 卷第 11 期 2007 年 11 月
环 境 科 学 ENVIRONMENTAL SCIENCE
Vol. 28, No. 11 Nov. , 2007
堆肥化过程中微生物群落的动态
王伟东 , 王小芬 , 朴哲 , 刘长莉 , 高秀芝 , 崔宗均
( 1 黑龙江八一农垦 大学生命科技学院 , 大庆 科学与工程学院 , 扬州 225009)
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境
科
学
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程中微生物区系是存在频繁的更替、 还是微生物群 体占据优势后不再更替等方面存在分歧
[ 4, 10~ 12]
取及后续纯化过程见参考文献[ 4] . 1 42 变性梯度凝胶电泳 ( DGGE) 所需 PCR 反应
TM
.本
研究采用传统的平板分离法与 DGGE 技术相结合 , 研究堆肥化过程中不同微生物群落的动态变化 , 揭 示堆肥化过程中微生物区系的变化规律, 为有机固 体废弃物堆肥化利用的生产实践提供理论依据和技 术支持. 1 1 1 材料与方法 堆肥体系的构建 堆肥原料采用新鲜的鸡粪、 牛粪及干枯麦秸. 将鸡