大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化

大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化

【实验目的】

1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。

2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。

3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。

4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。

5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。

【实验原理】

1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。

2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：

（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；

（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；

（3）将样品内的细胞进行富集培养；

（4）制备噬菌体裂解液；

（5）检测噬菌体是否存在；

（6）噬菌体的纯化及效价测定。

3.培养基的配制（配方）与灭菌

（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：

牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.

（2）牛肉膏蛋白胨培养液：

牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.

（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：

牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。

（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：

牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。

封好做好标记于121℃灭菌20min备用

【实验材料及器皿】

1.菌种：大肠埃希氏菌。

2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水

3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。

4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。

【实验方法步骤】

第一周：实验方案的讨论与完善

第二周：培养基的配制及相关实验器材的灭菌

牛肉膏蛋白胨固体培养基100ml，并取三个试管各加入3—4ml以搁斜面保留菌种

3X牛肉膏蛋白胨培养液50ml，装小三角瓶内

牛肉膏蛋白胨培养液100ml分装到5个大试管中，每管9ml，并依次标记10-5—10-1，剩余的装试管做好标记

离心管12个（包好）

无菌水2管（3—4ml每管）

玻璃涂布器3个（包好）

将以上物品包好、做好标记，于121℃灭菌20min，对3个牛肉膏蛋白胨固体培养基搁斜面。

第三周：

周日下午

1. 接菌种：将大肠杆菌接种于搁号的斜面上（保留菌种）

2. 大肠杆菌的活化：挑取一环大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，（试管中）

3. 将大肠杆菌和敏感菌悬液于37℃恒温培养18h,备用。

周一中午

4. 取上述敏感菌培养液6ml至盛有50ml 3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养6h。

5. 将大肠杆菌菌种和剩余敏感菌培养液置于4℃冰箱保存备用。

周一晚上

6. 加污水100ml至敏感菌培养液和3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养。

周二晚上

7. 制备裂解液：将以上增殖的混合培养液用2500r/min 离心30min,取上清液

8. 将上清液再次用2500r/min 离心15min,取上清液4℃保存备用。

9. 融化固体培养基、倒平板3个，先在平板表面滴加培养至对数期的大肠埃希氏菌菌液数滴，用无菌涂布棒涂匀。带菌被平板培养基吸干后，在其上滴加上述上清液5-7滴于含菌平板表面，同时在同一平板的某区域上滴加无菌水对照。

10.将平板倒置于37℃恒温培养。

11.配置牛肉膏蛋白胨半固体培养基50ml，并按3.5ml每管分装到5个试管中，做好标记于121摄氏度灭菌20min。

周三下午：

12.观察平板，验证污水中是否有噬菌体（实验现象、结果见后面分析）

第四周：

周二晚上：

1、噬菌体样品的稀释：将已证明有噬菌体的上清液用牛肉膏蛋白胨培养液依次稀释为10-1，10-2，10-2，10-4，10-5 5个稀释度。

2、倒底层平板：取无菌培养皿5只，每个培养皿倒入约10ml牛肉膏蛋白胨琼脂培养基作底层，依次标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5稀释度。

3.制备上层混合液：制备噬菌体与敏感菌混合液，即在标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5共5支无菌试管中分别各加入0.2ml培养至对数期的大肠杆菌菌液，然后在各对应试管中加入相应稀释度的噬菌体液0.1ml后混匀，37℃保温5min，带噬菌体吸附侵入寄主细胞。

4.倒上层半固体琼脂平板：在上述各噬菌体和敏感菌的混合管中各加入3.5ml约50℃左右的上层牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基，立即摇动试管使培养基与菌液充分混匀，并对号倒在含有底层琼脂平板的表面，迅速铺平待凝。

5.培养：待上层琼脂凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱中培养。

周三下午：

6.观察实验结果（具体结果见后面分析）

7.清洗整理实验用具。

【实验结果及分析】

1.大肠杆菌斜面结果：“z”型线清晰均匀，斜面结果较好。