沙门氏菌的鉴定与PCR快速检测

沙门氏菌的鉴定与PCR快速检测

摘要：沙门氏菌是一种常见的重要的人畜共患病原菌，不仅能引起各种动物的沙门氏菌病，而且与人类多种疾病有关，在世界各地的食物中毒病例中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙门氏菌在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均有重要的意义。本实验通过SS培养基的培养以及革兰氏染色检测鉴定和纯化菌株，并选用操作简便、快速、费用低廉的热裂解法来获得细菌基因组DNA，同时对热裂解的时间进行了比较实验，以及对PCR检测的敏感性和所用引物的特异性进行了试验。结果表明，所培养的菌确为沙门氏菌；菌体煮沸时间2min即可得到比较好的PCR效果；通过PCR能检测出129 pg的沙门氏菌DNA。所设计的引物对沙门氏菌属有比较好的特异性。关键词：沙门氏菌；PCR；快速检验

Identification and Rapid Detection of Polymerase

Chain Reaction of Salmonella

Abstract: The strain was identified and purified by cultivation with SS media and Gram’s stain. The pyrolysis method was selected to obtain the genome DNA of Salmonella. Comparison of pyrolysis time, the sensitivity of PCR to the template DNA and the specificity of primer were studied. The results showed that the culture was absolute specific Salmonella. The better effectiveness of PCR was obtained when the mycelium of Salmonella was boiled for 2min. 129 pg DNA of Samonella would be able to detect by PCR. The primer used in this experiment was specific to Salmonella.

Key words : Salmonella；PCR；rapid detection

1 前言

1.1 细菌性食物中毒严重威胁人类健康

“民以食为天，食以安为本”。然而，近年来世界范围内的食品安全恶性事件屡屡发生，食源性疾病的发生率均居高不下。全球每年发生40－60亿例食源性腹泻，发展中国家每年有180万人口死于食源性腹泻；即使是在工业化国家，亦有30%以上人群患食源性病症[1]。在我国，微生物污染食品是最重要的卫生问题之一，它所引发的细菌性食物中毒是所有食物中毒中最普遍、最具爆发性的一种食物感染[2]。由于缺乏快速诊断及溯源技术，食源性疾病漏报率极高。据WHO估计，发展中国家食源性疾病漏报率高达95%以上，我国目前掌握的食物中毒数据也可能仅为我国实际发生的食源性疾病的“冰山一角”[1]。可引起食物中毒的细菌有沙门氏菌（Samonella.spp）、志贺氏菌（Shigela.spp）、金黄色葡萄菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特杆菌（Listeria monocytogenes）、肉毒杆菌（Clostridium botulinum）等等。

195 1.2 沙门氏菌的危害与检验

沙门氏菌是一种常见的重要的人畜共患病原菌，不仅能引起各种动物的沙门氏菌病，而且与人类多种疾病有关，在世界各地的食物中毒病例中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位[3]。因此沙门氏菌日益引起人们的高度重视，成为各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一[4]。

沙门氏菌是一群形态、培养、生化反应和抗原构造相类似的革兰氏阴性杆菌,种类繁多,已确认的沙门氏菌有2500个以上的血清型[5]。人们用传统的细菌培养法，从样品的采集、运送、增菌培养，分离培养、生化鉴定，到最后的血清分型，至少要用3-5天的时间，周期长，同时受到培养鉴定中许多因素的影响，阳性率不高，种种情况造成了病程延长或漏诊[6]。沙门氏菌的检测长期以来缺乏一种简便、快速、敏感性高和特异性强的理想方法。

1.3 基于PCR的检验技术

聚合酶链反应（polymerase chain reaction 简称PCR），是近代发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。PCR技术实际上是模板、引物、四种脱氧核苷酸及Mg2+存在的条件下，依赖DNA聚合酶在生物体或细胞之外进行的DNA酶促合成反应。PCR技术具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点，现已广泛应用于微生物检测、遗传病诊断等诸多领域。

PCR的基本原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长[7]。

本实验利用沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列[12～15]设计一对长度为25 bp的引物，选用了操作简便、快速、费用低廉的热裂解法提取DNA。建立一个快速、简便、费用低廉的PCR检测方法，为下一步的研究提供了很好的条件。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

伤寒沙门氏菌（Salmonella）、单细胞增生李斯特杆菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（E.coli）等购于广州市微生物研究所。

2.1.2 生化试剂

DNA片段快速纯化/回收试剂盒购于北京鼎国生物技术有限公司；乙醇购于洛阳市化学试剂厂；071740沙门氏菌的生化鉴定试剂盒购于广东环凯微生物科技有限公司。

2.1.3 引物合成

参照沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列，此基因序列是沙门氏菌属的高度保守序列[12～15]，由软件Primer Premier 5.0设计一对引物，长度为25bp，两引物间核苷酸长度为495bp。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

引物Ⅰ:5’-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G-3’