沙门氏菌的鉴定与PCR快速检测

沙门氏菌的鉴定与PCR快速检测
摘要：沙门氏菌是一种常见的重要的人畜共患病原菌，不仅能引起各种动物的沙门氏菌病，而且与人类多种疾病有关，在世界各地的食物中毒病例中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。

沙门氏菌在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均有重要的意义。

本实验通过SS培养基的培养以及革兰氏染色检测鉴定和纯化菌株，并选用操作简便、快速、费用低廉的热裂解法来获得细菌基因组DNA，同时对热裂解的时间进行了比较实验，以及对PCR检测的敏感性和所用引物的特异性进行了试验。

结果表明，所培养的菌确为沙门氏菌；菌体煮沸时间2min即可得到比较好的PCR效果；通过PCR能检测出129 pg的沙门氏菌DNA。

所设计的引物对沙门氏菌属有比较好的特异性。

关键词：沙门氏菌；PCR；快速检验
Identification and Rapid Detection of Polymerase
Chain Reaction of Salmonella
Abstract: The strain was identified and purified by cultivation with SS media and Gram’s stain. The pyrolysis method was selected to obtain the genome DNA of Salmonella. Comparison of pyrolysis time, the sensitivity of PCR to the template DNA and the specificity of primer were studied. The results showed that the culture was absolute specific Salmonella. The better effectiveness of PCR was obtained when the mycelium of Salmonella was boiled for 2min. 129 pg DNA of Samonella would be able to detect by PCR. The primer used in this experiment was specific to Salmonella.
Key words : Salmonella；PCR；rapid detection
1 前言
1.1 细菌性食物中毒严重威胁人类健康
“民以食为天，食以安为本”。

然而，近年来世界范围内的食品安全恶性事件屡屡发生，食源性疾病的发生率均居高不下。

全球每年发生40－60亿例食源性腹泻，发展中国家每年有180万人口死于食源性腹泻；即使是在工业化国家，亦有30%以上人群患食源性病症[1]。

在我国，微生物污染食品是最重要的卫生问题之一，它所引发的细菌性食物中毒是所有食物中毒中最普遍、最具爆发性的一种食物感染[2]。

由于缺乏快速诊断及溯源技术，食源性疾病漏报率极高。

据WHO估计，发展中国家食源性疾病漏报率高达95%以上，我国目前掌握的食物中毒数据也可能仅为我国实际发生的食源性疾病的“冰山一角”[1]。

可引起食物中毒的细菌有沙门氏菌（Samonella.spp）、志贺氏菌（Shigela.spp）、金黄色葡萄菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特杆菌（Listeria monocytogenes）、肉毒杆菌（Clostridium botulinum）等等。

195 1.2 沙门氏菌的危害与检验
沙门氏菌是一种常见的重要的人畜共患病原菌，不仅能引起各种动物的沙门氏菌病，而且与人类多种疾病有关，在世界各地的食物中毒病例中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位[3]。

因此沙门氏菌日益引起人们的高度重视，成为各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一[4]。

沙门氏菌是一群形态、培养、生化反应和抗原构造相类似的革兰氏阴性杆菌,种类繁多,已确认的沙门氏菌有2500个以上的血清型[5]。

人们用传统的细菌培养法，从样品的采集、运送、增菌培养，分离培养、生化鉴定，到最后的血清分型，至少要用3-5天的时间，周期长，同时受到培养鉴定中许多因素的影响，阳性率不高，种种情况造成了病程延长或漏诊[6]。

沙门氏菌的检测长期以来缺乏一种简便、快速、敏感性高和特异性强的理想方法。

1.3 基于PCR的检验技术
聚合酶链反应（polymerase chain reaction 简称PCR），是近代发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。

PCR技术实际上是模板、引物、四种脱氧核苷酸及Mg2+存在的条件下，依赖DNA聚合酶在生物体或细胞之外进行的DNA酶促合成反应。

PCR技术具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点，现已广泛应用于微生物检测、遗传病诊断等诸多领域。

PCR的基本原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。

因为新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长[7]。

本实验利用沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列[12～15]设计一对长度为25 bp的引物，选用了操作简便、快速、费用低廉的热裂解法提取DNA。

建立一个快速、简便、费用低廉的PCR检测方法，为下一步的研究提供了很好的条件。

2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌种
伤寒沙门氏菌（Salmonella）、单细胞增生李斯特杆菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（E.coli）等购于广州市微生物研究所。

2.1.2 生化试剂
DNA片段快速纯化/回收试剂盒购于北京鼎国生物技术有限公司；乙醇购于洛阳市化学试剂厂；071740沙门氏菌的生化鉴定试剂盒购于广东环凯微生物科技有限公司。

2.1.3 引物合成
参照沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列，此基因序列是沙门氏菌属的高度保守序列[12～15]，由软件Primer Premier 5.0设计一对引物，长度为25bp，两引物间核苷酸长度为495bp。

由上海生工生物工程技术服务有限公司合成
引物Ⅰ:5’-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G-3’
引物Ⅱ:5’-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3’
2.1.4 培养基
营养肉汤，SS琼脂，LB培养基等购于广东环凯微生物有限公司。

2.1.5 主要实验仪器
培养箱（ZDP-250；上海精宏实验设备有限公司）；超净工作台（SW-JC-1F；上海一恒科技有限公司&上海蓝豹实验仪器有限公司）；Eppendorf 梯度PCR仪（德国）；飞鸽牌高速冷冻离心机（TGL-16G）（上海安亭科学医学仪器厂）；水平电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），凝胶成像系统（美国BIO-RAD），核酸蛋白质测定仪（美国BIO-RAD）。

2.2 方法
2.2.1 沙门氏菌的培养、纯化与鉴定
2.2.1.1 分离培养[16]
左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将培养皿盖揭开呈20度左右的角度（角度越小越好，以免空气中的细菌进入培养皿中将培养基污染，右手持接种环，从培养肉汤中取少许材料涂布于SS培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再在所涂材料的地方轻轻接触，开始划线。

2.2.1.2 纯化培养
将37℃分离培养24h的SS琼脂平板从温箱取出，挑取单个菌落，经革兰氏染色镜检，证明无杂菌，此时用接种环在单个菌落的中央表面轻轻挑取培养物少许，移于琼脂斜面培养。

2.2.1.3 革兰氏染色[17]
①抹片在火焰上固定，用结晶紫染色1min。

②水洗后，加碘溶液于片上，助染1min。

③将碘溶液倾去，水洗后，用95%酒精脱色约半分钟。

应将玻片不时摇动，至无色素脱下为止，脱色时间的长短，与涂片厚薄有关。

④水洗后，以碱性复红染液复染0.5－1min.
⑤水洗、吸干、镜检。

2.2.1.4 生化鉴定
利用071740沙门氏菌的生化鉴定试剂盒进行鉴定。

2.2.2 模板DNA制备方法
取细菌培养液1ml，置于Eppendorf管中，进行8000 rpm离心5min收集菌体，用灭菌双蒸水洗涤两次，最后用200 ul的双蒸水悬浮，隔水煮沸，时间分别为2、5、10、15、20、30min ，8000 rpm 离心10 min ，上清即为模板DNA。

2.2.3 PCR扩增
PCR反应体系总体积为25ul，反应体系如下：
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DNA 模板 1 ul
引物Ⅰ 1 ul
引物Ⅱ 1 ul
10×PCR buffer 2.5ul
MgCl2（25mM） 2.5 ul
DNTPs（10mM） 0.5 ul
Taq酶（5U/ ul） 0.2 ul
ddH2O 16.3 ul
25ul
PCR程序参数：
94℃→94℃→60℃→72℃→72℃35 cycles
4′ 45″ 45″ 1′ 10′
2.2.4 PCR产物鉴定
2.2.4.1 PCR产物电泳
配制1.0%琼脂糖凝胶，取10 ul PCR产物进行点样，100V电泳30min后，取出凝胶，置紫外灯下观察，并凝胶成像系统照相。

2.2.4.2 PCR 产物回收
利用PCR回收试剂盒进行回收，步骤如下：
①切取含有DNA片段的琼脂糖，用吸头捣碎按重量1：3（切取重量：溶液A的体积比），加入溶液A。

②65℃水浴10分钟，胶完全溶化即可，其间可振荡助溶2－3次，待溶化后置室温加入15 ul 溶液B，充分混匀。

③将溶液于离心柱中静置2 min，1000 rpm 离心3 min.
④倒掉液体加入500 ul溶液C 于离心柱中， 8000 rpm 2 min 弃液体。

⑤重复步骤④。

⑥12000 rpm 再次离心 1 min 甩干剩余液体以除去残余酒精。

⑦将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管放置5－10 min 使乙醇挥发殆尽。

⑧加入20－30 ul 溶液D（50℃水浴），静置2 min。

⑨15000 rpm离心 1 min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于－20℃，可长期保存。

3 结果与分析
3.1 菌株在SS培养基上的分离土培养与革兰氏染色鉴定
挑取一环菌株在SS培养基上进行划线分离培养，经过37℃，24小时培养后，培养的菌株在SS 培养基上形成有黑色菌斑。

因为沙门氏菌能产生H2S，与SS培养基成分的柠檬酸铁反应产生黑色物
质，表明所培养的菌为是沙门氏菌；经过革兰氏染色镜检，进一步证实，与沙门氏菌的形态特征相符合。

3.2 煮沸时间对DNA模板和PCR效果的影响
菌液经过不同时间煮沸后的电泳结果表明（图1），随着煮沸时间的延长，细菌DNA大量降解，且与煮沸时间存在一定的正相关性，当煮沸2min时，DNA基本上没有降解，但DNA较少；当煮沸5min和10min时，DNA有少量降解，此时DNA量较多；当煮沸15-30min时，DNA明显降解，相对完整的DNA量较少。

对不同时间煮沸处理获得的DNA进行的PCR分析（图2），图中所标的数字前面为煮沸时间，后面为PCR体系中模板的量。

结果表明，煮沸法获得的DNA尽管含有较多的杂质，但并不影响PCR效果，不同煮沸时间均可扩增出500bp左右的片段。

从图中还可以看出在取1 ul上清液作模板时，获得PCR的量与煮沸时间呈正相关，在获得同样PCR效果的前提下，应以煮沸时间越短越好，煮沸时间以2 min为宜。

3.3 PCR对DNA模板量要求检测
由核酸蛋白质测定仪测得原液中
DNA含量为1290.39 ng/ul，进行10倍的梯度稀释，对不同稀释度的模板进行PCR扩增，结果显示在
10－4仍有较暗的条带，表明该PCR扩增体系能检测出129pg 的沙门氏菌DNA（图
3）。

3.4引物特异性检测
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由图4可见，只有沙门氏菌能扩增出大约500bp的带，而其他非沙门氏菌（单细胞增生李斯特杆菌、大肠杆菌）均无扩增带，表明这对引物是沙门氏菌的特异性引物。

3.5 PCR产物回收效果检测
由图5可见，由试剂盒回收PCR产物的效果是比较好的，完全可以进行后续实验。

4 讨论
传统抽提DNA的提取的方法主要都是参照分子生物学实验指南或分子克隆实验指南的方法进行的，这些方法操作步骤繁多，费用也相对较高。

本实验对细菌DNA提取进行了改进，经过多次实验中发现煮沸时间并不需要太长就可以达到检测的效果，可以大大缩短沙门氏菌的检测时间。

这种方法操作简便、快速、费用低廉，易于推广应用。

PCR 技术以其敏感性、特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于微生物检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性。

近年来已越来越广泛地受到重视，已应用于多种病毒和细菌的诊断[13]。

影响PCR反应结果的因素较多，主要包括：（1）模板：对模板要求PCR扩增不是很严格, 作标准研究可用蛋白酶K、酚等处理, 一般实际检测用快速煮沸法制取DNA , 即可满足要求, 不过这样制取的摸板最好现制现用, 它们不易保存[20]。

但在DNA溶液中，不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂（如EDTA）等，会与Mg2+络合，影响Taq DNA聚合酶的活性。

上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败[21]。

（2）引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。

要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)[18，19，21]。

必须考虑若干参数：引物长度、引物的解链温度、复制子的解链温度、二级结构、重复、GC夹、高GC含量片段的扩增、非目标同源[19]。

（3）Mg2+浓度：PCR反应体系中Mg2+浓度对扩增结果影响较大，Mg2+浓度太低会无PCR产物，太高又会导致非特异的产物产生。

通常是0.5－2.5 mmol/L，必要时可调整Mg2+浓度。

反应内容物中，dNTP能与Mg2+结会，所含EDTA会与Mg2+络合，高浓度的DNA也有干扰作用，都会影响Mg2+的有效浓度[21]。

（4）dNTP浓度：dNTP会络合溶液中的Mg2+，而且高浓度的dNTP会增加Taq 聚合酶的错配率，特异性下降，甚至会抑制Taq 聚合酶
的活性[21]。

（5）反应条件：PCR反应条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板的靶DNA序列，但反应的特异性下降；反之，特异性增加，但扩增效果不佳。

在实际操作时可设置梯度以确定最佳退火温度。

应用PCR技术检测沙门氏菌的关键之一，是需要一对属特异性引物以扩增所有沙门氏菌DNA。

本试验根据沙门氏菌的组氨酸操纵子基因合成一对引物，对沙门氏菌进行PCR扩增，结果表明所有的对照均不出现特异条带，因此，这对引物具有很强的沙门氏菌属特异性。

可以以本实验的方法来探索其它细菌的PCR检测，首先要找出他们的特异性引物，通过多次的摸索其最佳的实验条件，比如：模板浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度和退火温度等，使其有比较好的可重复性和特异性，然后再用这些特异性引物进行多重PCR，经过一次PCR扩增就可以检测几种食源性病原微生物，这样就大大缩短检测的时间。

已经有报道通过多重PCR同时检测32pg的沙门氏菌DNA和274pg单核细胞李斯特菌DNA[22]。

由于实验室条件的限制，没有进行大量的对照实验，只能对现有的非沙门氏菌进行PCR对照，样品数量不够多，沙门氏菌的数量也仅有一种。

建议实验室可以建立自己的一个菌种库，最后优化PCR条件，进而为检测非标准样品打下基础。

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