第十三章生物物质的分离与纯化

• 调节PH值
• 适当的PH值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中 的损失。此外，发酵液PH值的改变会影响发酵液中某些成分的电离程度，从 而降低发酵液的粘度。在调节PH值时要注意选择比较温和的酸和碱，以防止 局部过酸或过碱。草酸是一种较常用的PH值调节剂。
• 加入絮凝剂
• 通常情况下，细菌的表面都带有负电荷，可以在发酵液中加入带正电荷 的絮凝剂，从而使菌体细胞与絮凝剂结合形成絮状沉淀，降低发酵液的上粘 度，利于菌体的收获。
要求，成为级别的产品。
• 生物产品的后处理过程一般包括：发酵液 的预处理；提取；精制三个步骤 。
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第十三章生物物质的分离与纯化
•发酵液或培养液
•细胞产物 •离心或过滤
•（洗涤)
•干燥 •产物
•分离剂回收、再生 •分离剂回收、再生
•胞外产物
•胞内产物
图
13-1
•滤液
•滤渣
•滤渣
•循环
•离心或过滤 •（洗涤）
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第十三章生物物质的分离与纯化
•4、发酵醪的培养基残留成分中还含有无机盐类， 非蛋白质大分子其降解产物对提取和精制均有一定 的影响。 •5、发酵醪中除了发酵产物外，常有其他少量的代 谢产物。发酵过程中除了主代谢产物外，尚伴有一 些其他的副代谢产物。这些少量的副产物，有时其 结构特性与发酵主产物极为近似，这就会给分离提 纯操作带来困难。 •6、发酵醪中还含有色素、热原质、毒性物质等有 机杂质。尽管它们的确切组成还不十分明了，但它 们对提炼影响相当大。为了保证发酵产品的质量和 卫生标准，应通过预处理将色素、热原质、毒性物 质等有机杂质先除去。
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第十三章生物物质的分离与纯化
•2、固液分离方法
序号 方法
原理
设备
1
絮凝 利用电荷中和及大分子桥联
作用形成更大的粒子
2 3 4
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离心
过滤
膜分 离
在离心产生的策略场作用下， 高速冷冻离心机
加快颗粒的沉降速度
蝶片式离心机
管式离心机
倾析式离心机
筐式离心机
依据过滤介质的空隙大小进 行分离
第十三章生物物质的分离与纯化
•二、培养液的固液分离方法
•1、分离前的处理
• 加热
• 由于加热可能使某些热敏感性蛋白发生不可逆的变性，因此这种预处理 方法仅适用于对非热敏感性产品发酵液的预处理。适当加热之后，发酵液中 的蛋白由于变性而凝聚，形成较大的颗粒，发酵液的粘度就会降低，一般加 热的用65-80
•菌体及固体杂质
• 当发酵醪由转鼓中心进料入高速 旋转的转鼓内，由于固、液比重不同， 在碟片空间内由于离心力的作用下， 把发酵醪分成固相和液相两部分。比 重较轻的清液有规则地沿着碟片的上 表面向碟片轴心方向移动，由环形轻 液出口处排出，而比重较大的菌体及 浓缩物，则有规则地沿着上一个碟片 的底表面滑移到碟片边缘，经转鼓壁 上的喷嘴喷出收集于菌体收集器内， 从而达到分离菌体的目的。 • 此机的转速可高达600010000r/min左右。我国广州重型机械 厂生产的DP-400型酵母高速离心分离 机转速为6500r/min，可适用于发酵工 业的菌体分离。
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第十三章生物物质的分离与纯化
• 在提高单个分离技术的收效率的同时，注意各单元操作 间的有效组合和整体协调，以减少工艺过程的步骤；
• 快速，以提高生产能力。
•
就目前的发展和应用情况来看，在大多数生物产品
的开发研究中，后处理过程等的研究费用约占全部费用
的50%以上，在产品的成本构成中，后处理成本占总成
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第十三章生物物质的分离与纯化
•补充内容（二）
•发酵产物的分类
• 发酵成熟醪中常含有各种样的杂质，而所需要的发酵产物则 含量很少。因此，要获得纯净的发酵产物，它的提取与精制过程 便成为一个复杂而必不可少的工艺过程。提取和精制的目的在于 从发酵液中制取高纯度的、合符质量标准要求的发酵成品。 • 尽管由于菌种、发酵醪的特征及发酵工艺的不同，发酵产物 可以多种多样，但从工业发酵范畴来看，从发酵醪中获得产物大 致可分为三类：
• 鉴于生化产品具有如下特点：目的产物在初始物料中的含量低；
含目的产物的初始物料组成复杂，除了产物外，还含有大量的细胞、代谢 物、残留培养基、无机盐等；生物活性物质的稳定性差，对PH、温度、 金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，易失活、变性；生 化产品种类繁多，包括了大、中、小分子量的结构和性质复杂又各异的生 物活性物质；生化产品的应用面广，许多产品用作医药、食品、试剂等， 对含量和纯度要求高等。因此，应用于生化产品的后处理过程中的分离纯 化技术必须满足以下一些要求：
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第十三章生物物质的分离与纯化
应用于生化产品的后处理过程中的分离纯化技 术必须满足以下一些要求：
•条件温和，特别对具有生物活性的物质，在后处理过程中必 须保持其生物活性； •分离纯化技术的选择性好、专一性强，能从复杂的混合物中 有效地将目的产物分离出来，以达到较高的分离纯化倍数； •目的产物的量和活性具有较高的收率；
•3、发酵醪中的悬浮固体物主要含有菌体和蛋白质胶状物。由于发酵醪中存在一定 数量的菌体和蛋白质胶体物质，不仅使发酵醪粘度增加，不利于过滤，而且增加提 取和精制后工序的操作困难，在浓缩过程中变得更粘稠，同时容易产生泡沫。采用 溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在夺产生乳化，使溶媒相和水相分层困难；采用离 子交换法提炼时，蛋白质的存在也会增加树脂的吸附量，加重树脂的负担。
第十三章生物物质的分离与纯化
•破碎方法
表
13-2
细
•机械法
•非机械法
胞
破
碎
方
•固体剪切作用
•流体剪切作用
•干燥处理
•溶胞处理
• 核苷酸类物质发酵产物包括肌苷、肌苷酸以及鸟苷酸等。5`-肌苷酸和5`-鸟
苷酸均为呈味核苷酸，核酸的微生物包括辅酶A、ATP、辅酶I等均为重要的医药品。
• 抗生素发酵产物包括青霉素、链霉素、四环素、土霉素、金霉素、庆大霉素、
新霉素、红霉素及利福霉素等。
• 多糖发酵产物包括右旋糖酐及多糖B-1459等。多糖是医药和工业上重要粘性
本的40%-80%,对于精细胞和药用的产品，此比例就更
高。生产过程中后处理投入的人力和物力占全部的70%-
90%.
•
生物产品的后处理分离纯化技术和工艺不仅影响产
品的质量和成本，也决定着产品的产量。生化产品由于
没有适当的提取、分离和纯 化方法或因回收率太低致使
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第十三章生物物质的分离与纯化
•代谢产物
•
中间代谢产物包Baidu Nhomakorabea醋酸、乳、柠檬酸、葡萄糖酸、衣康酸及延胡索酸等。氨基
酸发酵产物包括谷氨酸、赖氨酸、色氨酸等。由于对菌种的变异和氨基酸代谢机理的 研究日益深入，所以其他氨基酸，除蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸外，18种氨基酸均可 用直接发酵法制造。
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第十三章生物物质的分离与纯化
• 有机溶剂发酵产物包括酒精、丙酮、丁醇等。
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第十三章生物物质的分离与纯化
•菌体 • 主要以菌体细胞作为发酵产品，如单细胞蛋白、面包酵母、饲料酶母等。此外就是
从菌体细胞中提取有用的发酵产物，如由酵母细胞提取辅酶A、核糖核酸等产品。有的抗 生素主要存在于菌丝体中，如灰黄霉素产生菌在发酵过程中所产生的灰黄霉素主要在菌 丝中，因此，也要从菌丝体中进行提取。
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•干燥 •产物
第十三章生物物质的分离与纯化
•一、培养液的预处理
•问题
•1、培养液的预处理的目的是什么？ •2、培养液的预处理包括哪些步骤？
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• 菌体细胞的分离 •固体悬浮物的去除 •蛋白质的去除 •重金属离子的去除 •色素、热原质、毒性物质等有机物质的去除 •改善培养液的处理性能 •调节适宜的PH和温度
物质来源之一，右旋糖酐经过部分水解后供代血浆用。多糖B-1459是水溶性、高分 子量的胞外异多糖。
• 维生素发酵产物有核黄素、维生素C和维生素B12.
• 甾体氧化的产物为甾体激素，是重要的品。如醋酸可的松、氢化可的松、醋
酸泼尼松、氢化泼尼松等促皮质激素及肾上腺皮质激素制剂、黄体酮、甲孕酮（安 宫黄体酮）等性激素、炔诺酮等避孕药。
•生产成本过高而不能投产的例子是屡见不鲜的。
• 不同的生化产品，由于自身的特性及其对纯度要求的不 同，所采用的分离纯化路线常常也是不同的。例如从发酵液中 提取和精制菌体和胞内酶，就与分离与纯化细胞的代谢产物有 明显的不同；同样即使产物都属于代谢产物，由于产物的化学
结构不同，其提取和精制的方法也就不同。但一般来说，分 离纯化路线都包括了两个基本阶段：产物的初级分离阶段；
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第十三章生物物质的分离与纯化
•问题
•1、发酵醪有哪些特性？
•2、发酵醪中获得产物大致可分
为
、
、
三类？
•3、发酵液中的细胞代谢产物有哪 些？分别举出2个具体代表产物。
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第十三章生物物质的分离与纯化
• 生化生产过程的最后一个环节是把目标产物从培养液或反应液
中分离提取出来。多数生化产品在生产过程中需经微生物发酵、酶反应过 程或动植物细胞大量培养，并通过包括产物回收、粗分离、纯化及精制等 处理后，才能符合一定的质量标准。在生物产品生产过程中一般将微生物 发酵、酶反应过程或动植物细胞大量培养称为“上游过程”，而与之相应 的产物回收、粗分离、纯化及加工等后续过程就称之为“下游过程”，或 称之为生化分离和纯化过程。众所周知，要使生物技术走向产业化，必须 要上下游过程兼容、协调、以使全过程能优化进行。
板框过滤机 平板过滤器
真空旋转过滤机
管式过滤器
蜂窝式过滤器
深层过滤器
依据被分离的分子大小和膜 孔大小进行分离
平板、卷曲、中空纤维、管式微孔过滤器 平板、卷曲、中空纤维，管式超滤器
平板渗透器
半透膜型、离子半透膜型电渗析器
第十三章生物物质的分离与纯化
•3、碟式离心机结构及工作原理
•进料 •轻液出口
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•酶 • 发酵产物为酶制剂，包括胞外酶和胞内酶。如α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、葡 萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、右旋糖酐酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、转化酶、蜜二 糖酶、柚苷酶、花青素酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、天冬氨酸酶、青霉素酰胺酶、 磷酸二酰酶、天冬酰胺酶等，均在工业上和医药上发挥作用。
•补充内容（一）
•发酵醪(发酵液)的 •一般特征
• 利用微生物发酵生产各种发酵产品，由于菌种不同和 发酵醪特性不同，其预处理方法和提取、精制方法的选择 也有差异。应针对发酵醪的特性来合理选择处理方法，大 多数发酵产物存在发酵醪中，也有少数发酵产物存在菌体 中，或发酵醪和菌体都 含有，例如四环类抗生素。各种发
第十三章生物物质的分 离与纯化
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2020/11/28
第十三章生物物质的分离与纯化
•第十三章 生物物质的分离与纯化
•教 学 内 容
•1、培养液的预处理 •2、培养液的固液分离 •3、细胞的破碎 •4、生物物质的分离纯化方法 •5、生物分离工艺介绍
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第十三章生物物质的分离与纯化
酵产物无论在发酵醪或是在菌中体现往往浓度较低，并与 种种的溶解和悬浮的杂质混在一起，要分离提纯发酵产物， 首先要针对发酵醪的特性进行预处理。
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第十三章生物物质的分离与纯化
•发酵醪的特性一般可归纳为：
•1、发酵醪大部分是水，一般含量达90%-99%.
•2、发酵醪中发酵产物浓度较低，尽管由于菌种、原料、工艺条件不同，发酵产物 于发酵醪中浓度的高低也有差异，但总的来说发酵醪中发酵产物浓度都是比较低的， 除了酒精、柠檬酸、葡萄糖酸等发酵产物浓度在10%以上外，其余的都在10%以下， 而抗生素的浓度更低，一般在1%以下。
•副产物
•废物
•细胞 •离心或过滤细胞 •副产物 •（洗涤）
•副产物 •废物
•循环
•废物
•细胞
生 物 产
•细胞破碎 •（化学法机 •械法等）
•整体细 •胞萃取
品 分 离
•含产物的清液
•预处理阶段
•离心、过滤
纯 化 的
•提取、分离 •沉淀、吸附、萃取、过滤等
•废物
一 般
步
•纯化、精制
骤
•层析、结晶、电泳等
产物的纯化精制阶段。
•
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第十三章生物物质的分离与纯化
• 初级分离阶段在细胞培养结束之后，其任务是 分离培养液、破碎细胞释放产物（如果产物在 胞内）、溶解包涵体、复原蛋白质、浓缩产物 和去除大部分杂质等。
•
纯化精制阶段是在初级分离的基础上，用
各种高选择的手段和方法，将目标产物和干扰
杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的