肌球蛋白轻链在肌肉再生中作用的体外实验研究
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骨骼肌具有很强的再生能力， 当肌肉严重损伤或 肌肉疾病时可刺激肌组织再生， 但肌肉再生的分子调 控机制目前尚不完全清楚。我们在比较蛋白组研究中 发现， 肌球蛋白轻链 （myosin light chain， Myl） 是在眼 外肌、 膈肌和腓肠肌之间表达不同的蛋白质之一。Myl 是肌小节粗肌丝的组成成分， 分为调节轻链 （Myl2） 和 碱性轻链 （Myl1、 Myl3 和 Myl4）两类
中国修复重建外科杂志2008年6月第22卷第6期
·753·
肌球蛋白轻链在肌肉再生中作用的体外实验研究
2 张素珍 1，
解慧琪 2
徐永 3
李秀群 2
邓力 2
陈晓禾 2
邱琳 2
杨志明 2
【摘 要】 目的 应用不同来源的成肌细胞 （myoblast， Mb） 研究肌球蛋白轻链 （myosin light chain， Myl） 在肌肉 再生中的作用， 为进一步了解 Myl 的生理功能提供依据。 方法 3 周龄健康雄性 C57BL/6 小鼠 12 只。采用酶消化法和 Preplate 技术分离纯化小鼠眼外肌、 膈肌和腓肠肌 Mb（eMb、 dMb 和 gMb） ， 进行传代培养。采用 RT-PCR 和 Western blot 法检测第 1 代细胞 Myl 的表达， 亚甲基蓝法检测细胞增殖能力， 倒置相差显微镜观察肌管形成情况。 采用浓度为 1、 2、 4、 8、 16 ng/mL Myl 单克隆抗体分别处理 3 种细胞 （实验组） ， 与未处理的细胞比较 （对照组） ， 观察细胞增殖能力及肌管形成的变 化。 结果 培养 24 h 的 eMb、 dMb 和 gMb 均检测到 Myl1、 Myl4 mRNA 和 Myl 蛋白表达， 且 eMb 的表达水平显著低 于 dMb 和 gMb （P < 0.01） ， dMb 和 gMb 间差异无统计学意义 （P > 0.05） ； 3 种细胞均未检测到 Myl2 和 Myl3 mRNA 表达。 eMb 的增殖速度高于 dMb 和 gMb（P < 0.01） ； eMb 和 dMb、 gMb 分别在接种后 40 h 和 16 h 出现肌管； 第 6 天 eMb 肌管 数为 （137.2 ± 24.5） / 视野， 显著高于 dMb 的 （47.6 ± 15.5） / 视野和 gMb 的 （39.8 ± 5.1） / 视野 （P < 0.01） ， 后两者差异无统 计学意义 （P > 0.05） 。Myl 抗体作用后， 3 种细胞实验组各浓度吸光度值均显著高于对照组 （P < 0.05） ， 表现浓度依赖性； dMb 实验组和对照组 16 h 肌管数分别为 （48.2 ± 7.1） / 孔和 （23.4 ± 4.9） / 孔， 6 d 肌管数分别为 （40.6 ± 10.2） / 视野和 （63.1 ± 6.1） / 视野， 两组间差异均有统计学意义 （P < 0.01） 。 结 论 Myl 可能通过促使 Mb 终末分化， 负性影响 Mb 增殖而在肌 肉再生中发挥一定作用。 【关键词】 肌球蛋白轻链 成肌细胞 增殖 肌肉再生 体外研究 小鼠 中图分类号： Q813.01 R329.24 文献标志码： A
[1-2]
pp1） ， 于 37 ℃、 5%CO2 及饱和湿度孵箱内培养 2 h， 然 后将未贴壁细胞转入另 1 孔 （pp2） 。48 h 后， 再将 pp2 中未贴壁细胞收集转入另 1 孔， 48 h 后得 pp3 细胞。 根据文献 [9] 报道 pp1 和 pp2 中含较多非肌肉细胞， 因 此弃去不用。将 pp3 细胞进行传代培养， 取第 1 代细 胞用于实验。眼外肌、 膈肌和腓肠肌来源的 Mb 分别 命名为 eMb、 dMb 和 gMb。 1.3 Myl 基因表达检测 1.3.1 RT-PCR 检 测 根 据 GeneBank Myl1、 Myl2、 Myl3 和 Myl4 的 cDNA 序列， 利用 ABI 的 Prim er Express 引物设计软件设计引物， 由上海生工生物工程有限公司合 成。 Myl1： 上游引物 5'-TGCCCATGATGCAAGCTATCTC-3'， 下 游 引 物 5'-ATCTTCTCTCCCAGAGTGGCGA-3'， 148 bp； Myl2：上 游 引 物 5'-AGAACAGAGACGGCTTCATCG-3'， 下 游 引 物 5'-TCAGCATCTCCCGGACATAGT-3'， 258 bp； Myl3：上 游 引 物 5'-CCAAGAACAAGGACACTGGCA-3'， 下 游 引 物 5'-CGCTTCATAGTTGATGCAGCC-3'， 197 bp； Myl4：上 游 引 物 5'-GCAAACCCAAGCCTGAAGAGA-3'， 下 游 引 物 5'-GTTGATGCAGCCATTGGCA-3'， 263 bp； GAPDH： 上 游 引 物 5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'， 下游 引 物 5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'， 191 bp。 收 集 培 养 24 h 的 eMb、 dMb 和 gMb， 按 Trizol 说明书提取细 胞总 RNA。取 0.8 µg RNA 进行逆转录， 得到第 1 股 cDNA 后， 产物用于扩增目的基因。Myl1 ～ 4 的 PCR 条件为： 94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 72 ℃ 5 min， 30 个循环； GAPDH 的 PCR 条件为： 94 ℃ 5 min， 94℃ 30 s， 57℃ 30 s， 72℃ 30 s， 72℃ 5 min， 30 个循环。PCR 产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 采用 Quantity One 1-D 软件分别对目的基因和内参照 GAPDH 的扩增产物进行半定量分析， 并计算其比值。 每组 6 个样品。 1.3.2 Western blot 检 测 细 胞 裂 解 液 裂 解 细 胞， 超 声波处理， 于 4℃， 10 000 × g 离心 10 min， 取上清， 用 Bradford 法测定总蛋白浓度。溶解于加样缓冲液的总 蛋白质经 12% SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后， 转移 至聚偏二氟乙稀膜， 室温下脱脂奶粉封闭 1 h， 加入 Myl 抗体 （1 ∶ 800） ， 4 ℃过夜； 室温下二抗 （1 ∶ 50 000） 孵 育 2 h， 增强型化学发光试剂显色。GAPDH 为内参照。 每组 6 个样品。
AN EXPERIMENTAL STUDY OF THE ROLE OF MYOSIN LIGHT CHAIN IN MYOGENESIS IN VITRO/ZHANG Suzhen1,2, XIE Huiqi2, XU Yong3, LI Xiuqun2, DENG Li2, CHEN Xiaohe2, QIU Lin2, YANG Zhiming2. 1School of Life Science, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China; 2Division of Stem Cell and Tissue Engineering, State Key Laboratory of Biotherapy,
基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （30670734） ； 四川省科技厅青年基金资助项目 （042Q026-038） 1 四川大学生命科学学院 2 四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室 · 干细胞与组织工程研究室， 610041） 3 肿瘤生物治 作者单位： （成都， ； 疗研究室 E-mail:orthop@publ ic.cd.sc.cn 通讯作者： 杨志明， 教授， 博士导师， 研究方向： 组织工程，
Zhiming, E-mail: orthop@public.cd.sc.cn extraocular muscle, diaphragm and gastrocnemius muscle myoblasts (eMb, dMb and gMb) were isolated and purified from 12 3-week-old C57BL/6 mice by using the enzyme digestion and Preplate technique, and then were subcultivated. The Myl expression in Mb was detected by RT-PCR and Western blot analysis; the Mb prol iferation activity was tested by methylene blue assay, and the myotube formation was observed. After anti-Myl antibody (1, 2, 3, 8, 16 ng/mL) was induced in the Mb culture (experimental group), the abil ity of prol iferation of myoblasts and the myotube formation were identified. Meanwhile, the Mb which was cultured without anti-Myl antibody was indentified as the control group. Results The results of RT-PCR and Western blot analysis showed that Myl1 and Myl4 mRNA and Myl protein were expressed in eMb, dMb and gMb at 24 hours after seeding, and their expression level were lower in eMb than in dMb and gMb (P < 0.01), and the latter two did not show any significant difference (P > 0.05). Myl2 and Myl3 mRNA was not detected in these three myoblasts. The prol iferation assay showed that the eMb prol iferated faster as compared with dMb and gMb (P < 0.01). eMb began to yield myotubes at 40 hours after seeding and dMb and gMb at 16 hours after seeding. At 6 days, the number of myotubes derived from eMb was (137.2 ± 24.5)/ field, which was significantly larger than that of myotubes from dMb [(47.6 ± 15.5) / field ] and gMb [(39.8 ± 5.1)/ field ] (P < 0.01). There was not statistically significant difference between the latter two groups (P > 0.05). After the antibody treatment, the absorbency values of the eMb, dMb and gMb in the experimental groups at each antibody concentration point were significantly higher than those in the corresponding control groups (P < 0.05), and the dose-dependent way was performed. The numbers of myotubes from dMb at 16 hours were (48.2 ± 7.1)/ well in the experimental group and (23.4 ± 4.9)/ well in the control group, and at 6 days were (40.6 ± 10.2)/ field in the experimental group and (63.1 ± 6.1)/ field in the control group.
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State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University. Corresponding author: YANG Objective To investigate the role of myosin l ight chain (Myl) in myogenesis in vitro. Methods The 【Abstract】
·754·
Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, June 2008, Vol. 22, No.6
There was statistically significant difference between the experimental and control groups (P < 0.01). Conclusion Myl may play a role in myogenesis through the negative effect on the myoblast prol iferation. Myosin l ight chain Myoblast Prol iferation Myogenesis Study in vitro Mouse 【Key words】 Foundation items: National Natural Science Foundation of China (30670734); Science Foundation of Sichuan Province (042Q026-038)
骨骼肌具有很强的再生能力， 当肌肉严重损伤或 肌肉疾病时可刺激肌组织再生， 但肌肉再生的分子调 控机制目前尚不完全清楚。我们在比较蛋白组研究中 发现， 肌球蛋白轻链 （myosin light chain， Myl） 是在眼 外肌、 膈肌和腓肠肌之间表达不同的蛋白质之一。Myl 是肌小节粗肌丝的组成成分， 分为调节轻链 （Myl2） 和 碱性轻链 （Myl1、 Myl3 和 Myl4）两类
中国修复重建外科杂志2008年6月第22卷第6期
·753·
肌球蛋白轻链在肌肉再生中作用的体外实验研究
2 张素珍 1，
解慧琪 2
徐永 3
李秀群 2
邓力 2
陈晓禾 2
邱琳 2
杨志明 2
【摘 要】 目的 应用不同来源的成肌细胞 （myoblast， Mb） 研究肌球蛋白轻链 （myosin light chain， Myl） 在肌肉 再生中的作用， 为进一步了解 Myl 的生理功能提供依据。 方法 3 周龄健康雄性 C57BL/6 小鼠 12 只。采用酶消化法和 Preplate 技术分离纯化小鼠眼外肌、 膈肌和腓肠肌 Mb（eMb、 dMb 和 gMb） ， 进行传代培养。采用 RT-PCR 和 Western blot 法检测第 1 代细胞 Myl 的表达， 亚甲基蓝法检测细胞增殖能力， 倒置相差显微镜观察肌管形成情况。 采用浓度为 1、 2、 4、 8、 16 ng/mL Myl 单克隆抗体分别处理 3 种细胞 （实验组） ， 与未处理的细胞比较 （对照组） ， 观察细胞增殖能力及肌管形成的变 化。 结果 培养 24 h 的 eMb、 dMb 和 gMb 均检测到 Myl1、 Myl4 mRNA 和 Myl 蛋白表达， 且 eMb 的表达水平显著低 于 dMb 和 gMb （P < 0.01） ， dMb 和 gMb 间差异无统计学意义 （P > 0.05） ； 3 种细胞均未检测到 Myl2 和 Myl3 mRNA 表达。 eMb 的增殖速度高于 dMb 和 gMb（P < 0.01） ； eMb 和 dMb、 gMb 分别在接种后 40 h 和 16 h 出现肌管； 第 6 天 eMb 肌管 数为 （137.2 ± 24.5） / 视野， 显著高于 dMb 的 （47.6 ± 15.5） / 视野和 gMb 的 （39.8 ± 5.1） / 视野 （P < 0.01） ， 后两者差异无统 计学意义 （P > 0.05） 。Myl 抗体作用后， 3 种细胞实验组各浓度吸光度值均显著高于对照组 （P < 0.05） ， 表现浓度依赖性； dMb 实验组和对照组 16 h 肌管数分别为 （48.2 ± 7.1） / 孔和 （23.4 ± 4.9） / 孔， 6 d 肌管数分别为 （40.6 ± 10.2） / 视野和 （63.1 ± 6.1） / 视野， 两组间差异均有统计学意义 （P < 0.01） 。 结 论 Myl 可能通过促使 Mb 终末分化， 负性影响 Mb 增殖而在肌 肉再生中发挥一定作用。 【关键词】 肌球蛋白轻链 成肌细胞 增殖 肌肉再生 体外研究 小鼠 中图分类号： Q813.01 R329.24 文献标志码： A
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pp1） ， 于 37 ℃、 5%CO2 及饱和湿度孵箱内培养 2 h， 然 后将未贴壁细胞转入另 1 孔 （pp2） 。48 h 后， 再将 pp2 中未贴壁细胞收集转入另 1 孔， 48 h 后得 pp3 细胞。 根据文献 [9] 报道 pp1 和 pp2 中含较多非肌肉细胞， 因 此弃去不用。将 pp3 细胞进行传代培养， 取第 1 代细 胞用于实验。眼外肌、 膈肌和腓肠肌来源的 Mb 分别 命名为 eMb、 dMb 和 gMb。 1.3 Myl 基因表达检测 1.3.1 RT-PCR 检 测 根 据 GeneBank Myl1、 Myl2、 Myl3 和 Myl4 的 cDNA 序列， 利用 ABI 的 Prim er Express 引物设计软件设计引物， 由上海生工生物工程有限公司合 成。 Myl1： 上游引物 5'-TGCCCATGATGCAAGCTATCTC-3'， 下 游 引 物 5'-ATCTTCTCTCCCAGAGTGGCGA-3'， 148 bp； Myl2：上 游 引 物 5'-AGAACAGAGACGGCTTCATCG-3'， 下 游 引 物 5'-TCAGCATCTCCCGGACATAGT-3'， 258 bp； Myl3：上 游 引 物 5'-CCAAGAACAAGGACACTGGCA-3'， 下 游 引 物 5'-CGCTTCATAGTTGATGCAGCC-3'， 197 bp； Myl4：上 游 引 物 5'-GCAAACCCAAGCCTGAAGAGA-3'， 下 游 引 物 5'-GTTGATGCAGCCATTGGCA-3'， 263 bp； GAPDH： 上 游 引 物 5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'， 下游 引 物 5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'， 191 bp。 收 集 培 养 24 h 的 eMb、 dMb 和 gMb， 按 Trizol 说明书提取细 胞总 RNA。取 0.8 µg RNA 进行逆转录， 得到第 1 股 cDNA 后， 产物用于扩增目的基因。Myl1 ～ 4 的 PCR 条件为： 94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 72 ℃ 5 min， 30 个循环； GAPDH 的 PCR 条件为： 94 ℃ 5 min， 94℃ 30 s， 57℃ 30 s， 72℃ 30 s， 72℃ 5 min， 30 个循环。PCR 产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 采用 Quantity One 1-D 软件分别对目的基因和内参照 GAPDH 的扩增产物进行半定量分析， 并计算其比值。 每组 6 个样品。 1.3.2 Western blot 检 测 细 胞 裂 解 液 裂 解 细 胞， 超 声波处理， 于 4℃， 10 000 × g 离心 10 min， 取上清， 用 Bradford 法测定总蛋白浓度。溶解于加样缓冲液的总 蛋白质经 12% SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后， 转移 至聚偏二氟乙稀膜， 室温下脱脂奶粉封闭 1 h， 加入 Myl 抗体 （1 ∶ 800） ， 4 ℃过夜； 室温下二抗 （1 ∶ 50 000） 孵 育 2 h， 增强型化学发光试剂显色。GAPDH 为内参照。 每组 6 个样品。
AN EXPERIMENTAL STUDY OF THE ROLE OF MYOSIN LIGHT CHAIN IN MYOGENESIS IN VITRO/ZHANG Suzhen1,2, XIE Huiqi2, XU Yong3, LI Xiuqun2, DENG Li2, CHEN Xiaohe2, QIU Lin2, YANG Zhiming2. 1School of Life Science, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China; 2Division of Stem Cell and Tissue Engineering, State Key Laboratory of Biotherapy,
基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （30670734） ； 四川省科技厅青年基金资助项目 （042Q026-038） 1 四川大学生命科学学院 2 四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室 · 干细胞与组织工程研究室， 610041） 3 肿瘤生物治 作者单位： （成都， ； 疗研究室 E-mail:orthop@publ ic.cd.sc.cn 通讯作者： 杨志明， 教授， 博士导师， 研究方向： 组织工程，
Zhiming, E-mail: orthop@public.cd.sc.cn extraocular muscle, diaphragm and gastrocnemius muscle myoblasts (eMb, dMb and gMb) were isolated and purified from 12 3-week-old C57BL/6 mice by using the enzyme digestion and Preplate technique, and then were subcultivated. The Myl expression in Mb was detected by RT-PCR and Western blot analysis; the Mb prol iferation activity was tested by methylene blue assay, and the myotube formation was observed. After anti-Myl antibody (1, 2, 3, 8, 16 ng/mL) was induced in the Mb culture (experimental group), the abil ity of prol iferation of myoblasts and the myotube formation were identified. Meanwhile, the Mb which was cultured without anti-Myl antibody was indentified as the control group. Results The results of RT-PCR and Western blot analysis showed that Myl1 and Myl4 mRNA and Myl protein were expressed in eMb, dMb and gMb at 24 hours after seeding, and their expression level were lower in eMb than in dMb and gMb (P < 0.01), and the latter two did not show any significant difference (P > 0.05). Myl2 and Myl3 mRNA was not detected in these three myoblasts. The prol iferation assay showed that the eMb prol iferated faster as compared with dMb and gMb (P < 0.01). eMb began to yield myotubes at 40 hours after seeding and dMb and gMb at 16 hours after seeding. At 6 days, the number of myotubes derived from eMb was (137.2 ± 24.5)/ field, which was significantly larger than that of myotubes from dMb [(47.6 ± 15.5) / field ] and gMb [(39.8 ± 5.1)/ field ] (P < 0.01). There was not statistically significant difference between the latter two groups (P > 0.05). After the antibody treatment, the absorbency values of the eMb, dMb and gMb in the experimental groups at each antibody concentration point were significantly higher than those in the corresponding control groups (P < 0.05), and the dose-dependent way was performed. The numbers of myotubes from dMb at 16 hours were (48.2 ± 7.1)/ well in the experimental group and (23.4 ± 4.9)/ well in the control group, and at 6 days were (40.6 ± 10.2)/ field in the experimental group and (63.1 ± 6.1)/ field in the control group.
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State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University. Corresponding author: YANG Objective To investigate the role of myosin l ight chain (Myl) in myogenesis in vitro. Methods The 【Abstract】
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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, June 2008, Vol. 22, No.6
There was statistically significant difference between the experimental and control groups (P < 0.01). Conclusion Myl may play a role in myogenesis through the negative effect on the myoblast prol iferation. Myosin l ight chain Myoblast Prol iferation Myogenesis Study in vitro Mouse 【Key words】 Foundation items: National Natural Science Foundation of China (30670734); Science Foundation of Sichuan Province (042Q026-038)