基因克隆的策略
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抑制消减杂交
2次PCR 1st接头外侧（5‘）作引物； 2nd：接头内侧（3‘）作引物
应用的几个关键点：
①tester与driver配对密切，最好双方是同源细胞株，这样双方 才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系 密切．从而减少工作量，减少下一步工作的肓目性。
②在选用限制酶时应尽量选用对于基因组DNA中酶切位点较少 的限制酶，使酶切后产生的片段尽量大—些。例如使用Rsa I可 产生600 bp左右的片段，这样既可防止过长的cDNA片段影响杂 交效率，也可提高每个基因的代表性。
• Development of insect resistant crops
• Production of human insulin in transgenic bacteria carrying appropriate human gene
二、常用的克隆策略
• 图位克隆法 • 标签法 • 同源序列法 • 功能克隆法 • mRNA差异比较 • 利用EST数据库和更新的SAGE法 • 基因芯片 • RNA-seq • 基因文库及目的基因分离
Subtractive Hybridization ①生物素标记 ； ②cDNA与RNA复合体
Samples of Interest
mRNA Extraction Reverse transcription
cDNA RNA
Hybridization
cDNA
cDNA RNA RNA
Suppression Subtractive Hybridization (SSH)
-- Chromosomal landing: It is based on the principle that the expected average between-marker distances can be smaller than the average insert length of a clone library containing the gene of interest
5’-GCTTGATGCC-3’(H-AP-1 Primer) 5’-CTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs a-[33P-dATP] Taq DAN polymerase
GTTTTTTTTTTTCGAA
①3’端有12种组合锚定引物
②10核苷酸引导第2链合成
XY
③两引物扩增产物差异
• 哪些园艺植物适合做图位克隆？
• 你认为图位克隆最快捷的方法是什么？需 要注意哪些问题？
2. 标签法
• 转座子或T-DNA标签构建成质粒载体； • 载体导入目标植物 • 筛选群体 • 表型突变 • 扩增标签边上的基因
T-DNA插入引起的后果
（Krysan et al. 1999）
利用T-DNA突变体分离克隆基因
and the markers align perfectly except for a few inversions (indicated by arrows)
物理图谱（physical map)
物理图谱 基因所在DNA区域的物理特征 限制性酶切图谱 跨叠克隆群(contig)图谱 菌落杂交 PCR
TAIL-PCR
AD primer：任意简并引物 （Arbitrary Degenerate Primer）
反向PCR
质粒拯救
接头PCR
3. 同源序列法 PCR
❖ 基因同源性分析 保守序列 简并引物 ❖ PCR获得基因片段
或是RT-PCR获得cDNA片段 ❖ RACE法获取全长 ❖ cDNA片段做探针，从cDNA文库钓取全长
(d) Gene identification: Genetic complementation through transformation.
❖ 主要技术环节 ➢ 遗传作图 近等基因系 BSA ➢ 筛选连锁的分子标记 ➢ 目的基因的精细定位和作图 ➢ 目的基因分离 ➢ 目的基因鉴定
遗传作图 Genetic Map Genetic map – in this case, the maps of potato and tomato are aligned,
4. mRNA差异比较为基础的分离法
❖差异显示(mRNA differential display) DDRT-PCR (difference display RT-PCR)
❖差减杂交Subtractive Hybridization ❖代表性差异分析（Representational Difference Analysis，
RDA ） ❖抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，
SSH ❖竞争性杂交（ Competitive Hybridization）
Differential Display
Reverse Transcription
PCR Amplification GCTTGATGCC
目的基因分离
❖ 染色体步移法 在鉴定出紧密连锁的分子标记 所在的大片段克隆以后，以此为起点进行染色 体步移，逐渐靠近目标基因。可能中断或遇重 复序列转向。
❖ 染色体登陆 找出与目标基因的物理距离小于 基因组文库插入片段的平均距离的分子标记， 筛选文库直接获得含有目标文库的克隆。
图位克隆示意图
构建作图群体（F2、 BC1F1、RIL、DH或 NIL）
• A gene can be moved from one organism to another. An organism containing a "foreign" gene via genetic engineering process is called transgenic.
• Transgenic organisms can be used either for laboratory research to advance our understanding of biological processes or for specialized industrial applications – for examples:
Denaturing Polyacrylamide Gel
CAAAAAAAAAAAA-An TAAAAAAAAAAAA-An GAAAAAAAAAAAA-An 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs MMLV reverse transcriptase CAAAAAAAAAAA-An GTTTTTTTTTTTCGAA
• 巢式PCR • 多重PCR • 反向PCR • Touchdown PCR
4. mRNA差异比较为基础的分离法
❖Mutant and wild-type 表型差异： 不同基因型目标基因在细胞总DNA中所占比 例很小。mRNA仅代表那些在基因组中能够表 达的基因顺序。
❖同一材料不同时空背景、不同环境响应下 mRNA表达可能不同
第三节、基因克隆策略
一、目的与意义
• Isolation of gene enables the determination of its nucleotide sequence. determining –intron number and position、 promoter elements，etc.
侧翼序列（Flanked-sequence tag, FST）的 分离方法
• 热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR）
• 反向PCR（Inverse PCR，IPCR）
• 质粒拯救（Plasmid rescue）
• 接头PCR （Adaptor PCR）
筛选 Fiber-FISH DNA序列图谱
近等基因系（near iso-genic lines, NILs） 除了 目标基因所在座位的局部区域外，基因组 DNA序列的其余部分都是相同的。
BSA (Bulked segregant analysis)将分离群体中 研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分 成两组，将每组内一定数量的植株DNA等量 混合，形成两个池，这两个池除在目标性状 (抗病性)上有差异外，其余遗传背景均相同。 利用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差 异，这种多态性极可能与目标基因连锁。
分子标记作区段高 密度遗传连锁图
Chr
i
1.8cM 0.8cM 1.2cM 0.5cM 3.5cM
h g 基因X f e
d பைடு நூலகம் b
a
以距基因最近的两侧分子标记筛选文库（BAC,PAC or YAC 文库）， 分离片段末端进行染色体步查（chromosome walking)
1.8cM g
walking
图位克隆法步骤
(c ) Chromosome walking and landing:
-- Chromosome walking relies on isolation of a DNA fragment at or near an end of a cloned insert for use as a probe to screen the library and identify more clones.
在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基 因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图 谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆 的方法最终找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补 验证最终确定目的基因的碱基序列。
图位克隆方法分离基因的优点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需 预先知道其表达产物的有关信息。
• A comparison of DNA sequences between genes can lead to insights in gene evolution.
• Converting the DNA sequence of a gene into amino acid sequence by using the genetic code leads to a determination of the structure of the protein product of the gene, and from this knowledge, the function of the gene can be inferred.
图位克隆法步骤
٭90年代初发展起来的基因克隆技术。很多分离克隆的基 因都是通过这种方法获得的。
٭图位克隆法是基于基因在遗传图谱上的位置而分离克 隆基因的方法。
٭图位克隆法包括以下步骤：
(a) Target gene mapping: a high resolution genetic map with average distance is less than 5 cM. (b) Physical mapping: a map of the locations of identifiable landmarks on DNA, regardless of inheritance. Distance is measured in base pairs other than genetic recombination (in cM).
X gene
0.5cM
f
e
landing
图位克隆示意图
文库片段测序 Genscan和Blast，候选基因确定
转基因功能验证
Map-based cloning of Bph14, a resistant gene to rice brown planthopper
Du et al. Proceed. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106:22163-22168
1.图位克隆（Map-based cloning）法（未 知序列的基因克隆）
图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)，1986年， 剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染 色体上的位置进行基因克隆的一种方法。
2次PCR 1st接头外侧（5‘）作引物； 2nd：接头内侧（3‘）作引物
应用的几个关键点：
①tester与driver配对密切，最好双方是同源细胞株，这样双方 才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系 密切．从而减少工作量，减少下一步工作的肓目性。
②在选用限制酶时应尽量选用对于基因组DNA中酶切位点较少 的限制酶，使酶切后产生的片段尽量大—些。例如使用Rsa I可 产生600 bp左右的片段，这样既可防止过长的cDNA片段影响杂 交效率，也可提高每个基因的代表性。
• Development of insect resistant crops
• Production of human insulin in transgenic bacteria carrying appropriate human gene
二、常用的克隆策略
• 图位克隆法 • 标签法 • 同源序列法 • 功能克隆法 • mRNA差异比较 • 利用EST数据库和更新的SAGE法 • 基因芯片 • RNA-seq • 基因文库及目的基因分离
Subtractive Hybridization ①生物素标记 ； ②cDNA与RNA复合体
Samples of Interest
mRNA Extraction Reverse transcription
cDNA RNA
Hybridization
cDNA
cDNA RNA RNA
Suppression Subtractive Hybridization (SSH)
-- Chromosomal landing: It is based on the principle that the expected average between-marker distances can be smaller than the average insert length of a clone library containing the gene of interest
5’-GCTTGATGCC-3’(H-AP-1 Primer) 5’-CTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs a-[33P-dATP] Taq DAN polymerase
GTTTTTTTTTTTCGAA
①3’端有12种组合锚定引物
②10核苷酸引导第2链合成
XY
③两引物扩增产物差异
• 哪些园艺植物适合做图位克隆？
• 你认为图位克隆最快捷的方法是什么？需 要注意哪些问题？
2. 标签法
• 转座子或T-DNA标签构建成质粒载体； • 载体导入目标植物 • 筛选群体 • 表型突变 • 扩增标签边上的基因
T-DNA插入引起的后果
（Krysan et al. 1999）
利用T-DNA突变体分离克隆基因
and the markers align perfectly except for a few inversions (indicated by arrows)
物理图谱（physical map)
物理图谱 基因所在DNA区域的物理特征 限制性酶切图谱 跨叠克隆群(contig)图谱 菌落杂交 PCR
TAIL-PCR
AD primer：任意简并引物 （Arbitrary Degenerate Primer）
反向PCR
质粒拯救
接头PCR
3. 同源序列法 PCR
❖ 基因同源性分析 保守序列 简并引物 ❖ PCR获得基因片段
或是RT-PCR获得cDNA片段 ❖ RACE法获取全长 ❖ cDNA片段做探针，从cDNA文库钓取全长
(d) Gene identification: Genetic complementation through transformation.
❖ 主要技术环节 ➢ 遗传作图 近等基因系 BSA ➢ 筛选连锁的分子标记 ➢ 目的基因的精细定位和作图 ➢ 目的基因分离 ➢ 目的基因鉴定
遗传作图 Genetic Map Genetic map – in this case, the maps of potato and tomato are aligned,
4. mRNA差异比较为基础的分离法
❖差异显示(mRNA differential display) DDRT-PCR (difference display RT-PCR)
❖差减杂交Subtractive Hybridization ❖代表性差异分析（Representational Difference Analysis，
RDA ） ❖抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，
SSH ❖竞争性杂交（ Competitive Hybridization）
Differential Display
Reverse Transcription
PCR Amplification GCTTGATGCC
目的基因分离
❖ 染色体步移法 在鉴定出紧密连锁的分子标记 所在的大片段克隆以后，以此为起点进行染色 体步移，逐渐靠近目标基因。可能中断或遇重 复序列转向。
❖ 染色体登陆 找出与目标基因的物理距离小于 基因组文库插入片段的平均距离的分子标记， 筛选文库直接获得含有目标文库的克隆。
图位克隆示意图
构建作图群体（F2、 BC1F1、RIL、DH或 NIL）
• A gene can be moved from one organism to another. An organism containing a "foreign" gene via genetic engineering process is called transgenic.
• Transgenic organisms can be used either for laboratory research to advance our understanding of biological processes or for specialized industrial applications – for examples:
Denaturing Polyacrylamide Gel
CAAAAAAAAAAAA-An TAAAAAAAAAAAA-An GAAAAAAAAAAAA-An 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs MMLV reverse transcriptase CAAAAAAAAAAA-An GTTTTTTTTTTTCGAA
• 巢式PCR • 多重PCR • 反向PCR • Touchdown PCR
4. mRNA差异比较为基础的分离法
❖Mutant and wild-type 表型差异： 不同基因型目标基因在细胞总DNA中所占比 例很小。mRNA仅代表那些在基因组中能够表 达的基因顺序。
❖同一材料不同时空背景、不同环境响应下 mRNA表达可能不同
第三节、基因克隆策略
一、目的与意义
• Isolation of gene enables the determination of its nucleotide sequence. determining –intron number and position、 promoter elements，etc.
侧翼序列（Flanked-sequence tag, FST）的 分离方法
• 热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR）
• 反向PCR（Inverse PCR，IPCR）
• 质粒拯救（Plasmid rescue）
• 接头PCR （Adaptor PCR）
筛选 Fiber-FISH DNA序列图谱
近等基因系（near iso-genic lines, NILs） 除了 目标基因所在座位的局部区域外，基因组 DNA序列的其余部分都是相同的。
BSA (Bulked segregant analysis)将分离群体中 研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分 成两组，将每组内一定数量的植株DNA等量 混合，形成两个池，这两个池除在目标性状 (抗病性)上有差异外，其余遗传背景均相同。 利用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差 异，这种多态性极可能与目标基因连锁。
分子标记作区段高 密度遗传连锁图
Chr
i
1.8cM 0.8cM 1.2cM 0.5cM 3.5cM
h g 基因X f e
d பைடு நூலகம் b
a
以距基因最近的两侧分子标记筛选文库（BAC,PAC or YAC 文库）， 分离片段末端进行染色体步查（chromosome walking)
1.8cM g
walking
图位克隆法步骤
(c ) Chromosome walking and landing:
-- Chromosome walking relies on isolation of a DNA fragment at or near an end of a cloned insert for use as a probe to screen the library and identify more clones.
在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基 因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图 谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆 的方法最终找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补 验证最终确定目的基因的碱基序列。
图位克隆方法分离基因的优点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需 预先知道其表达产物的有关信息。
• A comparison of DNA sequences between genes can lead to insights in gene evolution.
• Converting the DNA sequence of a gene into amino acid sequence by using the genetic code leads to a determination of the structure of the protein product of the gene, and from this knowledge, the function of the gene can be inferred.
图位克隆法步骤
٭90年代初发展起来的基因克隆技术。很多分离克隆的基 因都是通过这种方法获得的。
٭图位克隆法是基于基因在遗传图谱上的位置而分离克 隆基因的方法。
٭图位克隆法包括以下步骤：
(a) Target gene mapping: a high resolution genetic map with average distance is less than 5 cM. (b) Physical mapping: a map of the locations of identifiable landmarks on DNA, regardless of inheritance. Distance is measured in base pairs other than genetic recombination (in cM).
X gene
0.5cM
f
e
landing
图位克隆示意图
文库片段测序 Genscan和Blast，候选基因确定
转基因功能验证
Map-based cloning of Bph14, a resistant gene to rice brown planthopper
Du et al. Proceed. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106:22163-22168
1.图位克隆（Map-based cloning）法（未 知序列的基因克隆）
图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)，1986年， 剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染 色体上的位置进行基因克隆的一种方法。