实验家兔骨折愈合骨组织形态计量学研究

实验家兔骨折愈合骨组织形态计量学研究
天津医院骨研所兰耋羹轰魏典
摘要作者应用骨组织形态计量方法测定丁132个(术后2～90天)实验家兔骨折血台标本的
15项骨计量学指标的变化。

并对所获指标数据进行丁计算机统计分析、制图处理，继而找出了骨折
自然愈合过程中的多种骨计量学指标参数。

提出骨折血台过程中，类骨质生成量及矿化沉积率变化
均旱驻峰样政峦瑚象
国内外学者多用病理学、组织化学和超
微结构等方法对骨折愈合和促进骨折愈合的
方法进行了研究0．2]。

这些研究方法所得结果
仅停留在单纯形态学水平，因而在评价骨折
愈台中常受主观因素的影响。

也由于这些方
法受技术条件所限，不可能为骨折实验模型
提供一组鉴定骨折愈合速度的客观指标。

而
常规观察骨折标本多进行脱钙制片，失掉了
占骨重2／S的矿物质，势必会在一定程度上
破坏骨组织形态，影响对骨折愈合的观察。

骨组织形态计量学(bone histomotphometfy
啪简称骨计量学)采用四环素活体双标记
方法，利用四环紊能与钙特异结合并沉积在
骨矿化前沿(minaralization front)的特性，在
荧光显微镜下观察骨内二次标记的四环素荧
光线距离等变化，从而求得骨矿化沉积率
(minaralization apposition rate)，骨体积(bone
volume)等十数项骨动力学及骨形态学指标。

本文采用骨计量学方法测量骨折愈合各
时期中新生骨痴的各种骨计量学指标变化，
找出与观察骨折愈合有关的骨计量学指标。

从而开辟研究实验骨折愈合和鉴定骨折愈合
速度的新方法，有利于促进骨折愈合(如：中
西药物、微量元素、器械方法等)和骨折愈合
机理的研究。

材料方法
一、实验性家兔骨折模型的制备和四环
紊标记方法及不脱钙切片的制作
本次实验选用家兔70只，在戊巴比妥钠静脉麻醉下，使用三角型双锯片电动摆锯，将家兔双侧桡骨中上1／S交界处锯成3mm宽的骨折缺损。

术后不傲任何固定，采用复合饲料喂养。

标记四环耳缘静脉注射两次，剂量为每公斤体重50II1g，首次在处死前9天，第二次在处死前3天。

共获骨折模型标本132十，其中有10只寡四环紊标记，按传统方法取材用于脱钙切片与不脱钙切片的对照观察。

处
死后的家兔即刻摄双前臂x线片，截取前臂
标本放入70蝣酒精4℃固定三天。

丙酮脱水后，采用甲基丙烯酸甲脂和丁脂进行包埋。

用Jung K型切骨机切出7岬l厚的不脱钙切片，再进行Giemsa。

VOfl Kossa．PAS．AB_PAS．PTAH等方法染色。

分别在荧光、偏光及普通光镜下观察。

二、骨计量学测量方法及测量指标先
将实验家兔骨折模型切片，参照传统的组织学观察将骨折端新生骨痴分为内、外、连接骨痴(图1)。

分别在100倍及200倍荧光、偏光
和(或)普通光镜下摄不同染色切片的各骨痴镜下视野。

每1例骨折标本切片，不同骨痴部位及观察方法下，要求摄12个以上的视野。

各术后观察组需相片50张。

本次测量包括了近万个骨折端骨痴镜下视野面积，共7百余
张相片。

⋯⋯丌”⋯
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镜下相片的测量是采用数字化仪(housto instrument 8024)连用IBM AT微机．使用AU—
TO-CAD软件处理，所获数据再输入微机使
用接骨计量学公式设计的统计分析程序进行数据处理。

并用医学数理统计程序进行统
计学处理及相关回归分析、显著性检验等。

类骨质体积等有关类骨质指标的测量是
在VOrl Kossa染色[ 的不脱钙切片上拍摄的彩色相片进行。

镜下成熟骨为黑紫色，类骨质为粉红色覆于骨小梁周边。

测量单、双四环紊标记荧光线长及宽等，均在荧光镜下摄片上进行(图2)。

测量成骨细胞表面长及骨吸收
陷窝表面长等指标是在Giemsa染色下拍摄
的彩色相片上进行。

另外，对上述三种相片均需测量骨体积(bone volume)、骨表面(bone surface)等指标，再通过计算机求出三张相片之平均骨体积(mean bone volume，Mev)、绝对类骨质体积(AOV)、相对类骨质体积(ROV)、平均类骨质宽(MOSW)、矿化沉积率(MAR)、纠正矿化沉积率(CMAR)、及矿化延
迟时间(MLT)等共15项指标。

详细测量方法
及选用指标均参照Revell、Parfltt、邱明才等口采用的骨计量学方法进行。

结果
一
、平均骨体积(MBV) 本实验的一般
组织学观察同诸学者在骨折愈合研究所见相
同。

骨折后，断端新生的内、外、连接骨痂的出
现与消失的时间不同
图2 在骨小粱周边骨矿化前婿沉积的四环素荧光枷一记线，荧光显做镜下200X
外骨痴是骨折愈合过程中最早出现的骨
痴，术后4天就有外骨痴生成。

镜下可见，骨
折端骨外膜深层的成骨细胞增殖，后经膜内
骨化成骨(intramembranous ossification)，此后外骨痴增加迅速．而且大量新生的编织骨
(woven bone)来自骨折处生成的纤维软骨性
骨痴，通过软骨内骨化成骨(endochondraI ossi—fiction)。

外骨痴新生骨小粱的MBV值，随术
后时间(44天前)的延长而迅速增加。

MBV值
与术后时间曲线星抛物线状．其顶点在4 天
(最大体积值为82．61 )，而后逐渐趋于下
降(图3)。

术后60天基本上被吸收而数值消
失。

其曲线经幂曲线回归分析拟合良好(拟台
优度为0．9044，回归系数为0．95l0，回归方
程为y一30．8903X P<0．001)
内骨痂出现时间晚于外骨痂，约在术后
6天，它不同于外骨痴即太部分骨生成来自
软骨内骨化生骨，而多为膜内骨化生骨镜下
可见，骨折端早期骨内膜即有增生，成骨细胞
直接生成骨小粱。

内骨痂的MBV值也呈抛物
线状，其顶点在术后32天(70．54 )。

40灭
以后，内骨痴基本消失(图3)。

此时骨折处的
骨羹腔已经再通。

连接骨痴出现的最晚，约在术后8天。

它
不同于内、外骨痂最终被吸收而消失，而是随
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)
DOl
一内f
一联接t
外t痂
⋯一
圈3 内、外、连接骨痂的MBV值阿术后时同变化曲线骨折愈合时间的延长，骨痂中MBV值逐渐增
大。

组织学观察可见到由早期编织骨向板层
骨一哈弗氏系统形态结构演变的过程。

连接
骨痂的MBV值呈一条对效曲线状上升，正好
说明这一现象经统计学处理，其对效曲线拟合良好，(拟合优度为0．9723，回归系数为0．9816，P<0．001)且具显著意义(图8)。

二、绝对类骨质体积(AOV)、相对类骨质
体积(ROV)、相对类骨质表面(ROS)、平均类
骨质宽(MOSW)和类骨质指数(o1)，此五项
指标均代表骨折愈合过程中类骨质生成效量
的变化。

其效值与术后时间曲线、均呈现一种“驼峰”样增高现象(图4，5) 其第一峰值高，出现在骨折后的14天。

此时的组织学观察，
各骨痂正处于成骨细胞增生活跃，生成大量
骨基质。

骨小梁步有钙化，软骨内骨化成骨活跃。

第二峰值较低，出现在术后的36天。

此时相当于骨折愈合分期的后期，主要特点为骨
痴的成熟及骨塑形的开始。

内、外骨痴体积明显减小，髓腔部分已开始再通。

此时测得的AOV等效值不如第一峰值大，但明显高于相
邻时间各组效值而具显著性。

三、矿化沉积率(MAR)、纠正矿化沉积率(CMAR)和矿化延迟时间(MLT)}三项指标分
别代表骨折愈合中，类骨质矿化成骨过程的
速度及时间过程。

各骨痴的MAR、CMAR效
中华骨科杂志1991年第l1卷第4期
值与术后时间曲线变化也呈一种“驼峰样
图●各骨癞平均的AOV值与木手时间变化曲线(●怖
图5 各骨蠹平均的ROY值与木后时间变化曲线(q )蠢膏
圈6 内、外、连接骨窗的CMA
R值随术后时间变化曲线
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中华骨科杂志1991年第l1卷第4期
(图6)。

在不同骨痴CMAR的高峰值出现时
间不同。

按高峰值出现时间顺序依次为内、外、连接骨痴，其间隔时间约8天。

最大的矿化沉积速度在30～50天。

这种现象同一般组织学观察到的骨折后新生骨小梁出现时间及骨痴的形成先后顺序相似。

MLT的测量数值与术后时间曲线变化具
有明显的周期性(图7)。

三个高峰值分别出
现在骨折后的ld天、24天及36天，两峰值间隔约l0天，而数值也逐渐下降。

(d)置震／更膏
图7 各骨痴平均的MLT值与木后时间变北曲线
圈8 连接骨瘟的MBV值与木后时问的对数曲线拟台讨论
一
、平均骨体积(MBV)与骨折愈合众
所周知，骨折愈合的组织学基础是由新生骨
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小梁(及骨皮质的再建)修复折损处(或缺损)
的骨而达到愈合的过程[2]，骨折后断端新生
的内、外、连接骨痴中MBV值变化．是观寨骨
折愈合与否及愈合强度、韧性的关键本实验
首次采用骨计量学方法，找出了实验家兔骨
折自然愈合过程中，各愈合时期各部位骨痴MBV增加的正常值及数值与书后时间变化
曲线。

并通过统计学处理证实，在骨折愈合
中，内、外骨痂MBV值与愈合时间曲线呈抛
物线状。

外骨痴是骨折后早期稳定断端的主要因
素，形成时间早，最大MBV值在术后4d天(82．61 )，能在骨折后的早期承受断端的扭
力和拉伸力从而恢复折骨的功能。

内骨痴为
暂时起连接断端作用，又最早的在骨塑形中
被吸收，故其撮大MBV值出现的较早也较小
(术后32天，70．54 )，也只能承担部分稳定
骨折断端作用。

连接骨痂的最大MBV值出现
时间最晚。

其数值与术后时间曲线也不同于内、外骨痴．是呈对数曲线上升(图8)。

此曲
线与骨折后力学恢复曲线一致。

可见骨折
撮终愈合及其功能的恢复与连接骨痴的
MBV值有直接关系。

因此骨折端连接骨痴的MBV值大小，即可代表骨折愈合及其功能恢
复的程度。

连接骨痂中骨小梁出现时间越早、MBV值越大．即表明骨折愈合程度越好。

二、骨痂中类骨质含量变化与骨折愈合
在骨折自然愈合中类骨质量的变化有一明
显特征，即类骨质的含量与骨折愈合时间曲
线呈现一种“驼峰”样增高现象。

骨折后早期，成骨细胞增殖生成大量类骨质，使形态学所
见类骨质含量迅速增加，在术后14天达第一
高峰值。

随后由于类骨质的矿化成骨，使所测得的类骨质量急剧减少，到术后28天降到较
低值。

而后由于骨生成的再次增加，类骨质含量又增多，36天时达第二高峰值，此后又再
次减少。

44天后．测量的类骨质含量数值已
很小，骨折也已基本达临床愈合。

这一现象与维普资讯
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时光达等测量实验家兔骨折骨痴中氨基酸含
量变化有两个高峰值的出现时间相一致。

从
而证实斌种类骨质量的变化是骨折愈合中的
一种客观现象。

在骨折愈合中，类骨质生成量的多少可间接体现出骨小梁的生成速度及骨
折的愈合速度。

能增加骨痴中AOV等的数值
或使高峰值出现时间提前，就Hj达到加速骨
折愈合的目的。

三、类骨质含量与骨基质钙化Jow~y (1977)0 认为，成骨细胞开始增殖后，即以
每天lpm的速度分泌胶原，胶原基质沉积到
l0～15)xm左右则开始钙化。

而钙化一出现，则在24小时内完成全部钙化的75 ，其余则
在较长时间内继续进行，直到骨完全钙化成熟。

谈现象被称为骨基质钙化的突变”现象。

本次观察到的类骨质含量的变化，第一高峰
值正好在术后l4天，即有骨胶原基质生成的儿～l2天(术后2天左右才出现成骨细胞增殖)。

而后类骨质量急剧减少是由于骨基质的
钙化，成熟骨量增多使AOV等数值减少。

这
种现象同骨基质钙化的突变学说相吻合。

同时类骨质量的变化驼峰”出现时间与骨折后羟磷灰石明显地开始结晶时间是在第13天
左右相符，也同本次研究观察MAR值的
高峰出现时间及MLT值的周期改变时间有
关联。

四、MAR、CMAR、MLT与骨折愈合的关
系MAR、CMAR数值代表骨折愈合的关
键一成骨时骨矿化的速度(u／天)。

由此数值不难推算出术后不同时期内的骨折愈合速度。

其MAR、CMAR值大者，骨折愈合修复亦快，反之则慢。

在骨折愈合中，MAR、CMAR数值与术后时闻曲线也呈“驼峰”样变化。

在二次较高的矿化沉积率之间，存在一较慢的矿化沉积率时相。

这一时相出现在术后24天左右。

这与此时大量类骨质多已矿化，而新生类骨质生成尚未达一定厚度嘲即骨基质钙化的“突变”现象有关。

中华骨科杂志1991年第l1眷第4期
MLT代表类骨质从形成到矿化的时间，
它是一个由类骨质宽度与MAR之比的相对
值l1]。

在这一时间内-骨腔原和骨基质发生许多生化变化，称之为类骨质的成熟过程，而所需要的时间则称为类骨质成熟时间(osteiod maturation time)。

由图7可见，骨折后新生骨痴的MLT数值与术后时间曲线呈周期性变
化。

从而证实，骨折后新生骨痂内类骨质的成熟时间同正常骨一样均有周期性。

这种现象
可能也与骨基质矿化的突变”现象有关。

小结
1_实验性骨折愈合的骨计量学研究是在
传统组织形态学观察的同时，进行新生骨痴
的定性、定量指标研究。

从而开辟了一项鉴定实验骨折愈合速度及对骨折愈合机理研究的
新技术、新方法。

2．在骨折愈合中，新生骨痴的平均骨体，
积(MBV)变化最明显。

内、外骨痴的MBV值
与术后时间曲线呈抛物线状上升，而连接骨
痂呈对数曲线上升。

各骨痂MBV数值变化均
与本身在骨折愈合中所起作用及与断骨的功
能恢复有直接关系。

3．矿化沉积率(MAR )纠正矿化沉积率(CMAR )是观察骨折愈合速度的关幢性指
标。

其数值越大，而显示骨折愈合速度亦越
快。

-
4．类骨质的各项指标变化均与骨折愈合
关系密切。

AOV等指标值的时间变化曲线均
呈“驼峰样。

此种变化与骨痂中氨基酸含量、
骨基质的钙化、骨痴中羟磷灰石的沉积等变
化有关。

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碳素纤维植人致骨坏死一例报告
北京军区总医院张龙海时述山季新民
患儿男，6岁因要儿瘫遣右■大肌麻痹，于
1986年6月在他院行骶棘肌代■肌术，用碳索纤维
麓接骶棘肌植于股骨上端。

1987年5月跌倒致右股
痛，摄片显示右股骨转子下1．|an×2．椭圆形透
亮区，边缣光滑锐利，局部骨干膨胀，皮质变薄，连续
性中断，无骨膜反应。

诊断右股骨上蛸。

骨囊肿旨并
肩理骨折．胫骨牵弓『8周骨折愈旨。

日骨囊肿”无自
愈债向，于1988年3月行“囊肿刮除植骨，术中见
大转子部皮下有一直径为1．5廿n索状结构，表面光
滑．呈均匀悬灰色．远端进入大转子下股骨内，索状
物与外栅骨皮质有0．5cm间酸与x线片破坏区一
致．为碾索纤维致骨质破坏。

取髂骨植于骨破坏周
围 3月后植骨愈合。

1989年9月从自行车上摔下，
碳索纤维植^区再次骨折，予石膏1目I动2月，骨折愈
合
讨论
碳素纤维除含碳元索外尚含小量磺，另有聚丙
烯长丝等填加剂。

这些物质一般对人无害，但存在个
体差异，有些人出现。

无菌炎症或骨破坏。

碳索纤维致骨破坏无自禽倾向，治疗应刮除坏死组织植骨，碳索纤维接箭膜条男植它处。

碳索纤维替代筋膜条能减少手术剖伤并转化为
新的纤维韧带。

由于个体反应可使部分手术失败，只有缺乏自身修复材料或切取材料后带来明显功能障
碍者，碳索纤维才是良好的替代材料。

(1990—2—6嘘稿1990—4—14蕾回)__。