关于人胚胎干细胞研究进展课件
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入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞
干细胞特性
S S E A -1 S S E A -3 S E A -4 T R A -1-60 T R A -1-81
AKP O ct-4 端粒酶活性 滋养细胞
培养条件
胚胎干细胞 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
滋养细胞 ＋无血清培养
胚胎干细胞系的建立过程
分离囊胚的内细胞群 分离胚胎生殖腺脊细胞
与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖
------胚胎干细胞的鉴定------定向诱导分化-------成体干细胞-----功 能细胞
1、干细胞来源：
(1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞 (2) 从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞 （embryonic germinate cells） (3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞
（embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT）
去核卵细胞 + 体细胞核 克隆 囊胚 分离内细 胞群 ES细胞
2、胚胎干细胞的分离
酶消化后培养 免疫方法去处滋养层细胞 流式细胞仪分离法
3、培养条件： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛 血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸； β-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入LIF，抑制细胞分化。
干细胞诱导分化的常用方法 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，
如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细
胞内
鉴定干细胞的常用方法： （1） 细胞形态与结构 （2）细胞功能 （3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 软 骨 细 胞 地塞米松，磷酸甘油
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 骨 细 胞 基因转染
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 胰 岛 素 分 泌 细 胞
＋ bFGF
生殖干细胞 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
未知 ＋ ＋
LIF＋ bFGF ＋ Forskolin
胚胎干细胞的诱导分化： 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养
胚 胎 干 细 胞 -------------------------------------------- 造 血 细 胞 RA
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 神 经 细 胞 DM SO
4、胚胎干细胞的鉴别 胚胎干细胞具有以下特点：
(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2)端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEΒιβλιοθήκη Baidu-3, SSEA-4,
TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植
（2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31； 细胞粘附分子整合素αvβ3 ；CD34 ；JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及MEC-14，7抗原
（3）特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2
心肌干细胞：
（1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛 的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片 钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If （3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链
关于人胚胎干细胞研究进展
•干细胞的基本概念 •胚胎干细胞系的建立过程 •胚胎干细胞研究的进展情况 •胚胎干细胞的研究意义 •胚胎干细胞研究的困难及解决办法
人体发生过程：
受精 卵裂
受精后72h
受精后5-7天
精子+卵子 合子
卵裂球
桑椹胚
囊胚
囊胚
滋养层胎盘及胎儿附属结构 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 肌 肉 细 胞 T G F -B 1, V E G F , b F G F
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 血 管 和 内 皮 细 胞 RA+胰 岛 素 +T3
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 脂 肪 细 胞 B M P -2, B M P -4
造血干细胞的鉴定：
（1） 细胞形态 ：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小 （2）细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1；
CD34；GATA-1； （3）基因表达：TAL-1；GATA-2 ；βH1；β主要珠蛋白
内皮细胞 :
（1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛 胞内连接；大量吞饮泡
横向分化： 部分干细胞在特定条件下可以转化为其它
细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为 各种血细胞系。
胚胎干细胞的性质
1. 衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 2. 永生化(immortal)； 3. 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 4. 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 5. 能参与胎儿所有组织的发育过程；
内细胞群 中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统
干细胞的基本概念
1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。
2、分类： （1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）
生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞） 具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 （2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发 育成完整个体的能力。 （3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。
干细胞特性
S S E A -1 S S E A -3 S E A -4 T R A -1-60 T R A -1-81
AKP O ct-4 端粒酶活性 滋养细胞
培养条件
胚胎干细胞 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
滋养细胞 ＋无血清培养
胚胎干细胞系的建立过程
分离囊胚的内细胞群 分离胚胎生殖腺脊细胞
与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖
------胚胎干细胞的鉴定------定向诱导分化-------成体干细胞-----功 能细胞
1、干细胞来源：
(1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞 (2) 从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞 （embryonic germinate cells） (3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞
（embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT）
去核卵细胞 + 体细胞核 克隆 囊胚 分离内细 胞群 ES细胞
2、胚胎干细胞的分离
酶消化后培养 免疫方法去处滋养层细胞 流式细胞仪分离法
3、培养条件： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛 血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸； β-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入LIF，抑制细胞分化。
干细胞诱导分化的常用方法 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，
如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细
胞内
鉴定干细胞的常用方法： （1） 细胞形态与结构 （2）细胞功能 （3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 软 骨 细 胞 地塞米松，磷酸甘油
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 骨 细 胞 基因转染
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 胰 岛 素 分 泌 细 胞
＋ bFGF
生殖干细胞 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
未知 ＋ ＋
LIF＋ bFGF ＋ Forskolin
胚胎干细胞的诱导分化： 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养
胚 胎 干 细 胞 -------------------------------------------- 造 血 细 胞 RA
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 神 经 细 胞 DM SO
4、胚胎干细胞的鉴别 胚胎干细胞具有以下特点：
(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2)端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEΒιβλιοθήκη Baidu-3, SSEA-4,
TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植
（2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31； 细胞粘附分子整合素αvβ3 ；CD34 ；JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及MEC-14，7抗原
（3）特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2
心肌干细胞：
（1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛 的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片 钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If （3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链
关于人胚胎干细胞研究进展
•干细胞的基本概念 •胚胎干细胞系的建立过程 •胚胎干细胞研究的进展情况 •胚胎干细胞的研究意义 •胚胎干细胞研究的困难及解决办法
人体发生过程：
受精 卵裂
受精后72h
受精后5-7天
精子+卵子 合子
卵裂球
桑椹胚
囊胚
囊胚
滋养层胎盘及胎儿附属结构 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 肌 肉 细 胞 T G F -B 1, V E G F , b F G F
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 血 管 和 内 皮 细 胞 RA+胰 岛 素 +T3
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 脂 肪 细 胞 B M P -2, B M P -4
造血干细胞的鉴定：
（1） 细胞形态 ：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小 （2）细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1；
CD34；GATA-1； （3）基因表达：TAL-1；GATA-2 ；βH1；β主要珠蛋白
内皮细胞 :
（1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛 胞内连接；大量吞饮泡
横向分化： 部分干细胞在特定条件下可以转化为其它
细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为 各种血细胞系。
胚胎干细胞的性质
1. 衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 2. 永生化(immortal)； 3. 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 4. 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 5. 能参与胎儿所有组织的发育过程；
内细胞群 中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统
干细胞的基本概念
1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。
2、分类： （1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）
生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞） 具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 （2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发 育成完整个体的能力。 （3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。