绿色荧光蛋白的研究

《生物工程进展》1997,V o l.17,N o.4

绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子

生物学研究领域的新标记物

岳莉莉　齐义鹏

(武汉大学病毒学研究所　武汉430072)

摘要　从多管水母属A equoren v ictu ria分离出的绿色荧光蛋白(GFP),因其特有的生物化学性质及该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广阔前景。本文就其研究进展及其应用进行简要综述。

关键词　GFP　荧光　基因表达　突变株　应用

基因的表达或蛋白质的定位及时序的变化常需要用荧光物质作为标记。这种标记也是免疫荧光和免疫组化的基础。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上,但是化学计量和染料附着的部位难于控制,因此尚需再次纯化。若该蛋白需用于活细胞内检测,最关键的问题是如何使其通过细胞膜。现在可用分子生物学的方法产生荧光蛋白,以取代传统的标记方法。常用的有荧火虫和细菌的荧光素酶基因,但由于它们都需要底物和辅助因子,因而在活体组织中的应用受到限制。由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质,且该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在生命科学中的应用具有美好的前景。本文就其研究进展进行简要综述。

一、绿色荧光蛋白的生物发光现象

早在六十年代初期,Sh i m om u ra等[1]首先从多管水母属(A equoria v ictoria)中分离出一种称为aequo ria的蛋白,该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光,当时称为光蛋白(p ho top ro tein)。它是分子量为20kD的单一多肽链,在其发光前,1M o l的aequo ria结合3M o l 的钙离子及1M o l非共价键结合的腔肠动物荧光素。尽管光蛋白体系本身发射蓝光,然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色,推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色荧光蛋白(green fluo rescen t p ro tein,GFP)[1,2]。M o rise 等[3]对GFP进行了分离和纯化,他们的实验结果表明,GFP的荧光发射峰在509nm,最大激发波长为395nm,并在475nm处有一肩峰。当将Ca2+加入到含低浓度GFP的aequo rin溶液中时,光谱接近于aequo rin发射的蓝光(Κm ax 472nm);而将aequo rin和GFP按大自然比例混合时,加入Ca2+,则光谱接近于活体的发射光(Κm ax509nm)。推测在活体内,GFP通过荧光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程,吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光。A equo rea发光系统分子间的能量转换过程如下:

A equo rin

Ca2+

B FP3+b lue L igh t

GFP

↓

激发

GFP3+ green ligh t

(B FP为蓝色荧光蛋白)

二、GFP的生色基团

从jellyfish A equorea v icioria分离出的GFP分子量约27230kD,为一单链多肽,它的生色基团(ch rom opho re)在各种苛性条件下(如热、极端pH、化学变性剂)都很稳定,比如用

酸、碱、或盐酸胍处理,一旦恢复中性pH环境,或是除去变性剂,荧光就可恢复并具有和原来一致的发射光谱[5,6]。绿色荧光蛋白独特的生物化学性质暗示它含有特殊的结构,它的生色基团和另外一种荧光蛋白——藻胆蛋白(Phyco2b ili p ro tein s)的生色基团完全不同,它是由链内几个被修饰的氨基酸残基经共价键连接而成。最初由Sh i m om u ra提出,并被大家所公认的生色基团化学结构见图1[7,8]

。

图1.Aequorea GFP的生色基团化学结构示意图

构成生色基团的3个氨基酸:Ser-dehy2

droT yr-Gly位于第65—67位,生色基团由丝

氨酸—脱水络氨酸—甘氨酸形成的对羟苯甲基

咪唑环酮(42P2hydroxybene252i m idazo linone)

构成,其上游第8个氨基酸为色氨酸,不寻常的

是这个色氨酸的荧光是检测不到的,可能是它

和生色基团之间的能量转移阻抑了色氨酸荧光

(320—350nm),这个色氨酸附近有多个脯氨酸

残基(P ro2V al2P ro2T ry2P ro),它的重要性现在

还不明了,但从蛋白质数据库(P I R ver25;

Sw iss2P ro tver14)中只找到细胞色素P2450蛋

白具有这种结构[9]。

三、GFP基因的克隆及特征

为了探索GFP发光的奥秘,传统的生物化

学技术一直没有得到满意的答案,进入九十年

代,采用分子生物学手段研究GFP,才使其有

了重大突破。1992年,P rasher等[9]根据GFP

的氨基酸序列合成了相应的寡核苷酸片段,以

此作探针从A.V ictoria的c DNA文库[10,11]中

筛选出了gfp的几个阳性克隆,并对EcoR1片

段的全序进行了分析,该序列有三个特征:1.此

c DNA共有965个核苷酸,而用N o rthern b lo t

证实的gfp m RNA全长是1105kb。215′末端非

编码区很短,只有26个核苷酸。31无Po ly(A)

尾,而gfp m RNA则有Po ly(A)尾。从c DNA

的序列推算:gfp含有一个开放阅读框,编码

238个氨基酸,分子量为26888kD,同经SD S—

PA GE测定的天然GFP的分子量(27230kD)

比较接近。由于用来构建基因文库的A.v ictori2

a基因组DNA来自于大量的jellyfish组织,电

泳纯化的GFP显示至少有三种主要的同分异

构体,其紫外吸收率(A395 A280)均在1110～

1125[8]。根据限制性酶切和Sou thern b lo t分析

这些阳性克隆,也发现至少存在有三种不同的

内切酶图谱,因而可能存在三种不同的gfp基

因,见图2。

与前述的gfp序列相比,gfp2基因在

216kb的DNA片段上,至少有3个外显子( 、

、 ),分别编码69、98和71个氨基酸,推测

在该基团组的上游可能还有一个外显子。生色

基团的氨基酸残基位于外显子 的3′末端。目

前尚不清楚这些c DNA是否来源于不同的gfp

基因,但它们的核苷酸和氨基酸确有不同之处。

见表1。