siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达

siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达

作者：缪应业，刘新，李浩，乔卿华，侯林虎，刘小圆，郝晓柯

【摘要】目的：构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ（KDR）基因的shRNA表达载体，研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响. 方法：将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1 neo线性质粒用T4 DNA连接酶连接，构建pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和Psilencer3.1 KDR3三个siRNA表达载体. 经酶切及DNA测序鉴定后，采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞，通过RT PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞生长速度的变化，流式细胞仪检测细胞周期的变化，以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1NC的PC3细胞为对照. 结果：酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体. RT PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明，pSilencer3.1KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA，下调蛋白表达;转染pSilencer3.1KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢. 结果表明, pSilencer3.1KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高，而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01). 而pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2无效. 结论：成功构建针对KDR基因的siRNA 表达载体，只有pSilencer3.1KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达，抑制PC3细胞的增殖.

【关键词】 RNA,小分子干扰;血管内皮生长因子受体;PC3细胞;前列腺肿瘤

0引言

血管内皮生长因子受体Ⅱ，又称激酶功能区受体(vascular endothelial growth factor Ⅱ, VEGFR2/kinase domain receptor, KDR)，其在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用. 研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGF KDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］. 我们用pSilencerTM3.1H1 neo在前列腺癌细胞系PC3内表达针对KDR 基因的短发卡状RNA(short hairpin small interfering RNA, shRNA), 阻断或降低细胞中KDR基因的表达，探讨KDR基因沉默后对PC3细胞增殖、生长的影响.

1材料和方法

1.1材料pSilencerTM3.1H1 neo质粒(美国Ambion公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；PC3细胞株为本室保存；鼠抗人KDR mAb, 羊抗鼠二抗,DAB显色液(武汉博士德公

司)；GAPDH内参及其mAb(上海康成生物有限公司)； pEGFPN2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.

1.2方法

1.2.1siRNA靶序列的设计及其表达载体构建根据siRNA设计原则［3］以及KDR(基因号AF063658)选取并针对KDR基因编码区（A：395～414 AACATGGAGTCGTGTACATTA；B：2969～2988 AAGCTCCTGAAGATCTGTATA；C：3906～3925 AAGCGGCTACCAGTCCGGATA），分别命名为（pSilencer3.1 KDR1, pSilencer3.1KDR2, pSilencer3.1KDR3）,序列经同源分析后，由北京赛百胜公司合成. 按操作说明将合成的DNA变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1 neo线性质粒连接，转化DH5α感受态细胞，LB平板（AMP+）筛选阳性克隆，提取质粒进行BamHⅠ, HindⅢ双酶切及琼脂糖电泳鉴定，并提交大连宝生生物公司进行测序.

1.2.2siRNA表达质粒转染PC3细胞提取测序正确的siRNA表达载体和pEGFPN2质粒并测定浓度. 将PC3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，siRNA表达载体转染PC3细胞按操作说明进行，每孔质粒用量为2 μg，脂质体用量为5 μL. 以任何已知序列不同源的shRNA 序列的质粒为阴性对照, 以带有绿色荧光蛋白的pEGFPN2质粒同步转染，荧光倒置显微镜于395 nm检测转染效率.

1.2.3RT PCR检测KDR的表达转染后48 h，提取总RNA并定量，用DNA酶Ι处理总RNA以去除DNA污染，取等量的RNA反转录后进行PCR. pSilencer3.1KDR1位点PCR引物正义链：5′GCCCAATAATCAGAGTGGCAGTG3′，反义链：5′GAGACGGACTCAGAACCACATCA3′，产物长度506 bp；pSilencer3.1 KDR2位点 PCR引物正义链：5′GCACGATTCCGTCAAGGG3′，反义链：5′TTCAAAGGGAGGCGAGCA3′，产物长度383 bp；pSilencer3.1KDR3位点PCR引物正义链：5′ACGGACAGTGGTATGGTT3′，反义链：5′CGAGTCAGGCTGGAGAAT 3′，产物长度279 bp. 内参照β肌动蛋白 PCR引物正义链：5′GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3′，反义链：5′CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′,产物长度353 bp. PCR产物经琼脂糖电泳后采用FR200图像分析系统分析.

1.2.4细胞总蛋白的提取及免疫印迹实验转染后72 h提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白浓度至相同水平进行SDS PAGE电泳，转膜、封闭；鼠抗人KDR一抗1/1000，GAPDH为1/1000，4℃过夜，加羊抗鼠二抗1/1000室温1 h；洗涤、DAB显色30 min. 采用FR200图像分析系统分析结果.