恶性肿瘤内乏氧状况的检测方法

恶性肿瘤内乏氧状况的检测方法

1955年，Thomlinson和Gray发现恶性肿瘤内存在乏氧细胞；1979年，Brown等证实了肿瘤乏氧有急慢性之分。经过多年的研究，临床有许多证据表明，肿瘤乏氧细胞的存在不仅能使肿瘤对放化疗的抗拒性增强，而且使肿瘤更具侵袭性，容易发生远处转移。尽管人们采取了许多克服肿瘤乏氧的措施，企图提高肿瘤治疗疗效，但临床结果均不令人满意，其原因可能有以下三方面：①临床已应用的措施无法有效的克服肿瘤乏氧；②影响肿瘤治疗疗效的因素有很多，而乏氧细胞存在仅仅是影响因素之一，并且与肿瘤增殖等因素相比，它可能是次要因素；③由于过去缺乏检测肿瘤乏氧的可靠方法，而没有能选择到获益的病人。近年来，随着影像学、免疫学、分子生物学和计算机等技术的发展，人们能够比较可靠地检测恶性肿瘤的乏氧状况。目前，已建立的检测方法有肿瘤血管分析、肿瘤代谢程度测定、肿瘤细胞的DNA损伤、乏氧相关蛋白(hypoxic stress proteins)分析、放疗效应评定、血氧合血红蛋白饱和度测定、放射性/荧光染色标记测定、肿瘤内氧压力测定等方法，而其中应用临床较广泛的具体方法有以下四种：①氧电极直接测定肿瘤内氧的压力；②组织形态分析；③DNA 带断裂分析；④乏氧标志物的测定［1］。本文就上述几种方法作一简要的综述。

1 氧电极测定

氧电极测定(oxygen electrodes)是近年来临床应用最广泛的方法之一，是唯一能直接测定肿瘤乏氧的方法，其测定结果能直观

地反映肿瘤的含氧情况。极谱氧电极是最早应用的技术，而后出现了极谱氧微电极技术，它现在被认为是测定肿瘤乏氧状况的“金标准”。利用此法测定肿瘤乏氧状况的参数有：①实测的肿瘤氧分压的平均值或中位数，一般认定＜10 mmHg为乏氧；②肿瘤乏氧比例(hypoxic fraction)，即实测的肿瘤氧分压的数据内，氧分压值＜2 mmHg或＜5 mmHg或＜10 mmHg所占的百分数［2］；③肿瘤乏氧容积(hypoxic subvolume,HSV),即肿瘤的容积乘肿瘤乏氧比例［3］。

目前，已有许多临床资料表明，用氧电极测定肿瘤乏氧的方法比较可靠，其测定结果与肿瘤治疗效应相吻合。但是，也存在不少局限性，主要有下列几方面：①由于肿瘤内氧分布存在明显异质性，故需多道多点测定，工作量较大。Wang等［4］报告用Eppendorf氧微电极测定宫颈癌含氧情况时，宜用5个测试道，每道测20～30个点。

②由于氧电极本身技术的局限，在测定时对信号反应率低和电极穿过基质和纤维组织时对电极末梢产生压力，故测定数据有误差，其结果较实际情况偏高［5］。③测定时不能区分氧电极是插入肿瘤活组织抑或坏死区，并且不能区别是否为急性或慢性乏氧。④由于测定时需要把氧电极插入肿瘤内，故有可能增加肿瘤转移的机会。

2 组织形态分析

组织形态分析(histomorphometric analysis)是最早应用于临床的方法。由于肿瘤的含氧状况主要依赖于肿瘤的血供情况，故通过分析肿瘤组织内毛细血管间距、血管密度、肿瘤坏死程度和周围正常组织内的血管与肿瘤相距最近的距离等指标，间接估测肿瘤的乏氧

状况，应用此方法检测肿瘤乏氧相对较可靠。许多资料表明，一些肿瘤(如宫颈癌和鼻咽癌)的血管分布情况与共治疗结果有明显相关性［6，7］。而且与其他方法相比，结果也较一致，Lung等［8］对宫颈癌分别用氧微电极测定和对肿瘤坏死区和血管密度检测，比较后发现两者结果相吻合。

但是，应用此方法检测肿瘤乏氧也存在一些不利点，除分析时需要较大的肿瘤组织块和专门的工作人员外，主要缺点是：由于此方法是利用肿瘤的供血情况间接反映肿瘤含氧量，所以在供应肿瘤血管内的血液携氧不足时，并不能真实反映肿瘤的含氧情况。肿瘤血管内的血液携氧不足可能是动静脉吻合支形成或血管内血液停流，也可能是血液内非氧合血红蛋白含量高。对于后者，可利用冷分光光度测定法(cryospectrophotometry)测定肿瘤微循环内血红蛋白的氧负荷，结合肿瘤内血管的分析，更可靠地反映肿瘤乏氧情况［2］。

3 乏氧标志物测定

乏氧标志物测定(hypoxia markers)是利用还原硝基有选择性结合乏氧细胞的能力而形成的一种从细胞水平测定肿瘤乏氧的技术，其原理是：肿瘤乏氧细胞还原能力强，当具有电子亲合力的硝基咪唑主动扩散透过细胞脂膜，在细胞内硝基还原酶作用下，硝基被还原，还原产物与大分子物质不可逆结合，滞留在组织内。而正常含氧细胞亲电子硝基咪唑还原产物立即被氧化，从而用硝基咪唑类化合物在肿瘤内的代谢程度来反映肿瘤的乏氧。

目前，测定硝基咪唑类化合物代谢程度的方法有两种：①用

放射性核素标记硝基咪唑类化合物，利用MRS、PET、SPECT和自显像等设备测定。常用的乏氧显像剂有82Br-MISO、18F-MISO、123I-IAZA、123I-IAZR和BATO(99TC标记)等［9］。②用硝基咪唑类化合物特异性抗体，利用免疫组织化学，酶联免疫吸附试验和流式细胞仪技术分析。近年来，人们开发了一种新型的乏氧细胞标志物Pimonidazole，用免疫组织化学分析后发现能可靠地反映肿瘤组织的乏氧状况［10］。Raleigh等［11］报告利用此法测定与氧电极测定的结果有明显相关性。

但是，应用乏氧标志物测定肿瘤乏氧时也有不利之处：需要专门的设备和试剂；一些解剖部位非特异高放射性浓聚产生高的背景信号影响分析；乏氧标志物在体内非特异性残留或结合到正常组织而产生误差。

4 DNA带断裂分析

DNA带断裂分析(DNA strand breaks)是利用肿瘤细胞对放疗产生不同效应的原理而间接测定肿瘤的乏氧状况，因为肿瘤受照射后乏氧细胞较富氧细胞可能表现出较少的DNA损伤。现在临床应用最广泛的方法是Comet assay，其测定结果比较可靠。Olive等［12］用Comet assay测定C3H鼠乳腺癌细胞的乏氧状况后表明此方法可靠易行，并且测定了7例腺癌病人的肿瘤后发现6例病人的肿瘤存在乏氧［13］。

与氧电极测定技术相比，DNA带断裂分析能区分肿瘤细胞和正常细胞，直接反映肿瘤的放射生物性乏氧的优点。但是，在实际的