八种常见食用油中甘油三酯组成的分析

八种常见食用油中甘油三酯组成的分析
杨悠悠刘佟苗雨田王浩杨永坛*
(中粮营养健康研究院，营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京102209)
摘要：基于液相色谱-电雾式检测器，建立了食用油中甘油三酯的分离分析方法。

借助液相色谱/质谱联用分析方法，鉴定出了大豆油中43种甘油三酯；并依据等碳数原则，确定了大豆油、花生油、菜籽油、玉米油等常见食用油中的甘油三酯组成。

以乙腈和异丙醇为流动相，采用梯度洗脱的方式并结合电雾式检测器进行甘油三酯的分离分析。

以α-亚麻酸甘油三酯、γ-亚麻酸甘油三酯、亚油酸甘油三酯及油酸甘油三酯等四种甘油三酯为模型化合物，经研究发现，四种甘油三酯在该检测器上具有类似的响应因子；另外，在信噪比（S/N=3）时,计算得到四种甘油三酯的检测限均为0.1 μg/mL。

基于甘油三酯的面积百分比定量研究，配备电雾式检测器的液相色谱方法能够更准确地提供甘油三酯组成的结果，更有利于差异分析研究。

该研究准确测定了8种常见食用植物油中各种甘油三酯的百分比组成。

关键词：液相色谱-电雾式检测器、甘油三酯、等价碳数法、食用油
Composition Analysis of Triacylglycerols in Eight Common Edible Oils
Yang YouYou, Liu Tong, Miao YuTian，Wang Hao，Yang YongTan* (COFCO Nutrition & Health Research Institute, Beijing Key Laboratory of Nutrition Health
and Food Safety, Beijing 1000209)
Abstract Triacylglycerols in edible oils were separated and analyzed using liquid chromatography with charged aerosol detector. With liquid chromatography/mass spectrometry, 43 triacylglycerols were identified in soybean oil. According to their equivalent carbon number, the composition of triacyglycerols in common edible oils such as soybean oil, peanut oil, canola oil and so on were determined. Using acetonitrile and isopropanol as the mobile phase, the triacylglycerols were separated with gradient elution. Glyceryl tri-α- linolenate, glyceryl tri-γ- linolenate, Glyceryl tri linoleate, glyceryl trioleate were used as the model triacylglycerols. It was showed that the response factors of those four triacylglycerols were similar. And under the optimized conditions, the detection limits were 0.1 μg/mL. Therefore, with the quantification methods of area normalization, the developed analyzing methods using liquid chromatography/charged aerosol
基金项目：中粮集团项目(2013-C2-F007)
收稿日期：
作者简介：杨悠悠，女，1984年出生，高级工程师，食品质量与安全检测。

通讯作者：杨永坛，男，1971年出生，教授级高级工程师，食品质量与安全。

detector could provide the accurate composition of triacylglycerols, which could facilitate the differential analysis. This work was applied in the analysis of triacylglycerols in 8 edible oils . Keywords:liquid chromatography with charged aerosol detector, triacylglycerol, equivalent carbon number, edible oils
食用植物油是人体重要的能量来源之一。

食用植物油中95%以上的成分为甘油三酯。

甘油三酯的骨架结构决定了甘油三酯的营养价值，随甘油三酯骨架上脂肪酸种类的不同营养价值也各异［1,2］。

目前，对于食用植物油的真伪鉴定，多采用脂肪酸组成及相关计量学方法[3]，而甘油三酯的结构鉴定及组成分析可为食用油的真伪鉴定提供更准确的更直接的证据。

因此，越来越多的油脂工作者对甘油三酯的组成和结构定性给予了很高的关注度。

甘油三酯的测定主要有气相色谱法[4]和液相色谱法[5,6]等。

使用气相色谱进行甘油三酯的直接分离分析时，需要使用超高温气相色谱柱，最高使用温度350 o C，对于多不饱和脂肪酸来说，容易发生热降解[7,8]。

使用液相色谱进行甘油三酯分析时，常用的检测器有蒸发光散射检测器、示差折光检测器、质谱仪、紫外检测器等[1]。

紫外检测器的要求是被测物质具有紫外或可见吸收官能团。

然而，由于食用油中甘油三酯组成复杂，不同甘油三酯所含双键数目和双键位置不同，因而具有不同的紫外吸收强度。

因此，基于面积归一化法，紫外检测器不能进行甘油三酯的准确定量。

示差折光检测器要求不能进行梯度洗脱，大大限制了了甘油三酯的分离；另外，示差折光检测器对环境要求高，基线较难平衡，灵敏度也相对较差。

蒸发光散射检测器可实现梯度洗脱，检出限较示差折光检测器可降低两个数量级。

蒸发光散射检测器与示差折光检测器一样，为通用型检测器，可检测无紫外吸收或吸收较弱的化合物如甘油三酯、糖等。

近年来，质谱检测器凭借其强大的结构解析功能，越来越多地应用在酯类化合物的检测中[9,10]，然而，不同化合物的质谱响应差别较大，因而也无法使用面积归一化法进行定量。

电雾式检测器(CAD)是近些年发展起来的通用型检测器，其检测灵敏度较高，检出限可小于1 μg/mL [11]，有利于目标分析物的真伪鉴定或指纹图谱研究。

本研究借助液相色谱-质谱联用的结构定性功能，依据等碳数原则，进行食用植物油中甘油三酯种类的确定；并基于液相色谱-电雾式检测器联用的检测分析技术，开发食用油中甘油三酯组成的分析方法，并将其成功应用于不同食用植物油中甘油三酯组成差异的比较分析。

1.材料与方法
1.1 材料与试剂
花生油、大豆油、玉米油等九种常见食用植物油购于当地商超；甲醇、异丙醇为色谱纯，
购自美国thermo fisher公司；α-亚麻酸甘油三酯、γ-亚麻酸甘油三酯、亚油酸甘油三酯和油酸甘油三酯的纯度均大于99%，购于美国Nu-Chek公司。

1.2 试验仪器
配备电雾式检测器（型号为Corona Veo RS）的液相色谱仪：型号为U3000，美国Thermo Fisher公司；十万分之一天平：型号为XS105，美国梅特勒-托利多公司；液相色谱质谱仪：日本岛津液相30A，质谱仪AB Sciex 5500 QTrap。

1.3试验方法
1.3.1样品预处理
称取约10 mg的食用植物油，溶于10 mL异丙醇，涡旋混合均匀，待液相色谱和液相色谱-质谱仪检测。

1.3.2液相色谱-电雾式检测器条件
使用waters Xselect HSS T3 (4.6 mm X 250 mm, 5 μm) 液相色谱柱，以乙腈(A)/异丙醇(B)为流动相，进行梯度洗脱。

流动相梯度洗脱条件为：0 min 0% B；5 min 0% B；25 min 20% B；
70 min 40% B；75 min 80% B；75.1 min 0% B；85 min 0% B。

电雾式检测器条件：雾化温度35 o C，采集频率10 Hz。

1.3.3液相色谱-质谱条件：
使用waters Xselect HSS T3 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)液相色谱柱，以乙腈/10 mmol/L甲酸铵水溶液(98:2, A) 和异丙醇/10 mmol/L甲酸铵水溶液(98:2, A)流动相，进行梯度洗脱。

流动相梯度洗脱条件为：0 min 0% B；5 min 0% B；25 min 20% B；70 min 40% B；75 min 80% B；75.1 min 0% B；85 min 0% B。

质谱离子源条件：ESI(+)；气帘气20 psi；气体1 55psi；气体2 55 psi；喷雾电压：5500 V；去簇电压：100 V。

1.3.4数据处理
以大豆油为例，基于液相色谱-质谱的定性功能，对各色谱峰进行定性，依据等价碳数原则(ECN)，即ECN=碳原子数-2倍双键数目，计算各色谱峰所代表化合物的ECN。

使用面积归一化法，依据液相色谱-电雾式检测法所得峰面积计算各ECN值的甘油三酯的百分含量。

2 结果与讨论
2.1电雾式检测器测定甘油三酯的性能评价
目前，甘油三酯组成的定量评价多数基于面积百分比法，为准确测定甘油三酯的百分含量，应尽量选择响应因子一致的检测器。

在最优化分离分析条件下，如图1所示，四种模型
化合物α-亚麻酸甘油三酯、γ-亚麻酸甘油三酯、亚油酸甘油三酯及油酸甘油三酯的响应因子几乎相同，见表1，相对标准偏差仅为2.10%。

相对于基于传统紫外检测的面积归一化定量来说，电雾式检测具有更高的准确度。

图1 α-亚麻酸甘油三酯、γ-亚麻酸甘油三酯、亚油酸甘油三酯及油酸甘油三酯的LC/CAD谱图。

1. α-亚麻酸甘油三酯; 2. γ-亚麻酸甘油三酯; 3. 亚油酸甘油三酯; 4. 油酸甘油三酯。

其次，食用油的真伪鉴别或指纹图谱分析中，低含量甘油三酯是主要关注点，是食用油的潜在标志物，因此，高灵敏度是油脂真伪鉴定分析所追求的目标。

如表1所示，电雾式检测器在甘油三酯分析中具有非常明显的优势，检出限可达0.1 μg/mL，检出限较紫外检测器和蒸发光散射检测器分别低一个和两个数量级。

另外，电雾式检测器分析甘油三酯也具有极好的重复性，信号响应的相对标准偏差小于3.0%。

因此，电雾式检测器在食用油甘油三酯组成分析中更具有优势。

表1 四种甘油三酯的响应因子、检出限及峰面积RSD
检出限/μg/mL 甘油三酯相对响应因子RSD(%,n=5)
CAD ELSD UV α-亚麻酸甘油三酯0.97 2.9 0.1 10 2
γ-亚麻酸甘油三酯 1.02 2.0 0.1 10 2
亚油酸甘油三酯 1.00 2.0 0.1 15 3.5
油酸甘油三酯0.98 2.5 0.1 20 7.5
2.2液相色谱分离分析食用油甘油三酯组成
基于电雾式检测器，该研究采用了非水反相液相色谱法分析食用油中甘油三酯。

通过优化流动相比例，以达到甘油三酯的最佳分离，尽量减少甘油三酯的共流出，如图2所示。

然而，由于食用油中甘油三酯种类众多，可达到数百种，凭借一维液相色谱的单一分离机理和分离能力，无法实现所有甘油三酯的基线分离。

等价碳原子数(ECN)规则的引入，可以有效降低甘油三酯定性的难度及增加甘油三酯定量的准确度，并能很好地应用于甘油三酯的基层实验室常规测试中。

因此，等价碳原子数的确定为关键点。

以大豆油为模型，该研究采用LC/MS对大豆油中的甘油三酯进行定性，并计算相应的ECN值，如表2所示。

通过ECN 规则，可将LC/MS鉴定出的43种甘油三酯分为ECN38、ECN40、ECN42、ECN44、ECN46、ECN48、ECN50、ECN52、ECN54九大类甘油三酯。

另外，由表2所知，在非水反相液相色谱中，甘油三酯的出峰顺序按照ECN从小到大顺序洗脱。

因此，根据甘油三酯响应对保留时间的色谱图，可确认甘油三酯响应对ECN的色谱图，如图2所示，并可以将其拓宽至其它种类食用油甘油三酯组成分析中，而无需重新对甘油三酯进行LCMS确认。

表2 由LC/MS鉴定出的大豆油中甘油三酯的类型
序号保留时间/min 甘油三酯名称ECN
1 23.55n 三亚麻酸甘油三酯36
2 26.92 二亚麻酸亚油酸甘油三酯38
3 30.39 二亚油酸亚麻酸甘油三酯40
4 30.67 二亚麻酸油酸甘油三酯40
5 31.51 二亚麻酸棕榈酸甘油三酯40
6 34.74 三亚油酸甘油三酯42
7 35.35 油酸亚油酸亚麻酸甘油三酯42
8 35.39 亚麻酸亚油酸棕榈酸甘油三酯42
9 39.01 二亚油酸二十碳二烯酸甘油三酯44
10 39. 7 二亚油酸油酸甘油三酯44
11 40.79 二油酸亚麻酸甘油三酯44
12 40.24 二亚油酸棕榈酸甘油三酯44
13 41.17 亚麻酸亚油酸硬脂酸甘油三酯44
14 41.52 二棕榈酸亚麻酸甘油三酯44
15 44.61 二亚油酸二十碳烯酸甘油三酯46
16 44.96 二油酸亚油酸甘油三酯46
17 45.61 二亚油酸硬脂酸甘油三酯46
18 45.90 亚油酸油酸棕榈酸甘油三酯46
19 46.71 二棕榈酸亚油酸甘油三酯46
20 47.22 亚麻酸硬脂酸棕榈酸甘油三酯46
21 50.56 亚油酸油酸二十碳烯酸甘油三酯48
22 51.07 三油酸甘油三酯48
23 51.66 亚油酸油酸硬脂酸甘油三酯48
24 51.32 二亚油酸花生酸甘油三酯48
25 51.66 亚油酸油酸硬脂酸甘油三酯48
26 51.98 二油酸棕榈酸甘油三酯48
27 52.57 亚油酸硬脂酸棕榈酸甘油三酯48
28 53.01 二棕榈酸油酸甘油三酯48
29 56.58 二油酸二十碳烯酸甘油三酯50
30 57.14 二亚油酸山嵛酸甘油三酯50
31 58.08 亚麻酸油酸山嵛酸甘油三酯50
32 57.42 亚油酸油酸花生酸甘油三酯50
33 57.52 二油酸二十碳烯酸甘油三酯50
34 57.98 二油酸硬脂酸甘油三酯50
35 58.89 二硬脂酸亚油酸甘油三酯50
36 59.11 油酸硬脂酸棕榈酸甘油三酯50
37 62.85 二亚油酸木蜡酸甘油三酯52
38 63.30 亚油酸油酸山嵛酸甘油三酯52
39 63.73 二油酸花生酸甘油三酯52
40 64.35 亚油酸硬脂酸花生酸甘油三酯52
41 65.29 二硬脂酸油酸甘油三酯52
42 68.89 木焦油酸亚油酸油酸甘油三酯54
43 71.05 油酸硬脂酸花生酸甘油三酯54
图2 大豆油的LC/CAD色谱图
2.3不同食用油中甘油三酯的组成分析
在最优化条件下，基于ECN规则，测定大豆油、花生油、菜籽油等8种常见食用植物油中甘油三酯的组成，其中，ECN=38,40,42,44,46,48,50,52,54为最主要的甘油三酯，不同食
用油中，各甘油三酯百分含量如表3所示。

其中，葵花籽油和花生油不含有甘油三酯ECN38和ECN40，可作为区分葵花籽油、花生油与大豆油、菜籽油和葡萄油的关键指标；除此之外，花生油中ECN42甘油三酯含量较其它食用油中ECN42含量小，可作为花生油的另一差异性指标；另外，玉米油中甘油三酯ECN50与其它食用植物油存在显著差异，其含量小于1.0%；橄榄油较特殊，所含甘油三酯ECN的范围较窄，仅含有ECN=44,46,48,50,52，不含有ECN=38,40,42的甘油三酯，另外，ECN=44的甘油三酯较其它食用油含量小得多，仅为2.97%，因此，对于橄榄油的掺假则可以依据ECN=38,40,42,44等甘油三酯的含量。

表3 大豆油等八种食用植物油中甘油三酯百分比组成
食用油
百分含量/%
ECN38 ECN40 ECN42 ECN44 ECN46 ECN48 ECN50 ECN52 ECN54
大豆油 1.48 8.58 24.62 29.51 21.61 10.14 2.50 1.55 0 玉米油0 0.79 21.31 38.66 28.44 10.33 0.46 0 0
葵花籽油0 0 24.79 35.75 24.12 10.35 3.52 1.47 0 花生油0 0 2.93 20.62 32.84 25.29 8.09 6.54 3.69 芝麻油0 0.18 12.17 26.74 31.03 23.01 5.74 1.12 0 菜籽油0.49 3.25 8.63 20.59 25.97 34.27 5.11 1.69 0 橄榄油0 0 0 2.97 14.07 71.10 10.40 1.47 0
葡萄籽油0 0.69 24.44 34.45 25.66 12.47 2.28 0 0
3 结论
基于液相色谱/电雾式检测器建立了花生油、玉米油等8种常见食用植物油中甘油三酯组成的分析方法。

与液相色谱紫外检测法或液相色谱蒸发光散射检测法相比，该方法具有更高的灵敏度，可更好地应用于低含量甘油三酯的检测分析中。

另外，该研究结合液相色谱-质谱法鉴定出大豆油中43种甘油三酯，通过引入等碳数规则，进行了不同食用植物油中甘油三酯的归类并测定了其百分比组成。

最后，该方法由于其高灵敏度及不同甘油三酯的响应一致性，可应用于花生油、玉米油、葵花籽油、橄榄油等不同食用植物油脂的差异化研究，以期应用于食用植物油的真伪鉴别中。

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