植物组织培养在无病毒苗培育中的应用

植物组织培养在无病毒苗培育中的应用毕可雷（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院06级）

摘要：大多数农作物，特别是无性繁殖的植物，易受多种病毒的侵染，感染马铃薯的病毒达20种以上，病毒感染植株后将导致农作物品种

产量和品质下降，在19世纪中叶，欧洲发生大面积马铃薯病害，使

产量损失近5%。如今，世界马铃薯种植业由于病毒病害，每年造成

生产上大面积减产15%以上，由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此若用未受侵染的个体的种子进行繁殖，就可得到无病毒植株，不过有性繁殖后代常出现较大的遗传变异，在园艺和林业中，品种的优良性状保持需通过营养繁殖来实现。因此，通过植物组织培养脱除病毒，培育无病毒苗木对农业生产具有重要意义。

关键词：植物组织培养无病毒苗脱毒

感病作物和健康作物的产量和质量差异很大，感染奥古巴花叶病毒的马铃薯产量只有0.4kg/10株，脱毒马铃薯产量达到4.5kg/10株。所以，培育无病毒苗对农业生产非常重要。

一、培育无病毒苗

1.1组织培养脱除病毒

1.1.1茎尖培养

茎尖是由顶端分生组织及下方1-3个幼叶原基一起构成的，大多数无病毒植物都是通过培养100-1000微米长的茎尖外植体得到的。

茎尖大小是茎尖培养能否脱除病毒及脱毒效率的限制因子。进行脱毒时，大小合乎脱毒需要的外植体很小，靠肉眼很难进行制备，需一台

带有适当光源的解剖镜，解剖时需注意防止外植体变干，超净台的气流和解剖镜上碘钨灯的散热都会对它产生影响，因此茎尖暴露的时间应越短越好。若在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖，有助于防止外植体变干。尽管茎尖区域是高度无菌的，在切取外植体之前，仍要对茎尖表面进行消毒，方法有多种，根据具体试验体系而定。

在茎尖培养中，影响脱毒效果的因素有：

1）培养基：通过正确选择培养基，可以显著提高获得完整植株的成功率。影响培养基主要性质的是其营养成分，生长调节物质、物理状态。茎尖分生组织培养脱毒苗所需的培养基包括多种大量元素和微量元素，现一般使用的是改进的MS培养基。另外还需添加细胞分裂素和生长素，在培养方法上，对容易褐化的外植体可采用液体培养，以减少培养物分泌的酚类化合物的浓度。

1.1.2愈伤组织培养

植物各种器官或组织诱导都可以产生愈伤组织，然后诱导愈伤组织分化芽，长成植株可获得脱毒苗。利用愈伤组织脱除病毒的原理是愈伤组织重细胞分裂旺盛，可抑制病毒复制，使部分细胞不含病毒。我国学者从感染PVY的马铃薯茎尖愈伤组织再生植株中获得46%无病毒植株。

1.2热处理脱毒

1.2.1高温短时处理法

这种方法利用病毒与植物耐热能力的不同，将苗木、接穗或种子等繁殖材料在一定的高温下处理一段时间，将其体内的病原菌杀死或

钝化，失去侵染能力，而保持其自身的生活力，从而达到脱毒的目的。该法尤其适用于类菌原体、类细菌的脱毒。

1.2.2低热长时处理法

低热长时处理一般不能使整株植物脱毒，而只能使个别器官脱毒，大多是使在热处理过程中长出的茎尖无病毒。因此处理后的最后步骤是要取新产生的茎尖嫁接到无毒实生砧木上或将茎尖进行扦插繁殖，以获得脱病毒植株。

二、脱毒苗的鉴定

脱毒苗必须通过无病毒检验才能把他们用作母株进行繁殖，在生产上推广使用。由于脱毒处理的再生植株中，很多病毒有一个延迟的复苏期，因此各种检验方法要在前18个月内进行若干次检验，以确定是否脱毒。

2.1抗血清鉴定法

植物病毒是蛋白质和核酸组成的核蛋白，给动物注射后，动物会产生抗体，形成抗血清。由于抗血清的特异性，可以鉴定未知的病毒种类。酶联免疫分析是最常用的检测方法，将病毒抗体固定在支持物上，加上待检抗原材料，然后加入酶标记的抗体，待检抗原与酶标记的抗体特异性结合后，通过酶与底物显色反应结果，用酶标仪进行定量检测。

2.2 RT-PCR法

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法是提取寄主的mRNA，反转录合成cDNA，然后通过利用病毒DNA特有的序列设计的引物进行

PCR反应，分析PCR反应物，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达，从而确定病毒是否存在。

三、无毒原种的保存

无毒植株并不具有额外的抗病性，他们有可能很快被重新感染，为了解决这个问题，应将无毒原种种在温室或防虫罩内灭菌的土壤中，在大规模繁殖这些植物的时候，应把它们种在田间的隔离区，会很少有感染的机会。

四、脱毒植株的应用

现在植物组织离体培养，特别是茎尖培养已成为一种公认的有效技术，运用这种技术，有可能消除存在于植物组织内的病原菌，从而获得无病菌的植株。这项技术所带来的好处已受到园艺工作者的重视，一方面，可导致农作物产量的增加和品质的改善，另一方面能促进植物活体材料的出口。随着越来越多国家规定只能进口经过检验证明无毒的植物，这种技术将会变得更为重要。

参考文献：

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[2]李浚明，朱登云，植物组织培养教程，中国农业大学出版社，2005，224-242

[3]张献龙，唐克轩，植物生物技术，科学出版社，2004，178-190