错配PCR致突变的实验条件研究

扩增效果很差，无法得到扩增产物。在 2.5 和 5.0
700 bp) , 100μlPCR 体系中含有:模板 DNA(pHB­ S050 ng 、引物各 20 pmol 、厂家提供的 PCR 缓冲
液(不含 Mg 2+)、 MgC1 2
mmol/L Mg 2+浓度下分别进行了 1 轮和 2 轮的
PCR 扩增，扩增产物分别克隆到 pGEM-T 载体中，
ຫໍສະໝຸດ Baidu
MnC1 2 ，将 dTTP 和 dCTP 的浓度提高到 1 mmol/L ， Mg 奸的浓度分别选用了 2.5 、 5.0 和 7. 5
mmol/L 的 MgC1 2 ，结果应用 7.5 mmol/L MgC1 2 时
1. 3
PCR 方法
1. 3. 1
常规 PCR
设计一对适当的引物，可以从
pHBSC 质粒 DNA 中扩增出其单链抗体的基因(约
个循环 PCR 后，将 PCR 产物克隆到 pGEM-T 载体
(Amp)-LB 琼脂板 ， 3TC 培养过夜，挑选 50 个集落
接种到 20 ml 含 Amp 的 LB 培养液中 ， 3TC 震荡培 养过夜，次日吸取 0.2 ml 菌液转种到 20 ml Amp-
中，随机挑选 2 个克隆测定了 1 340 个碱基的序列，
DNA 突变技术在生物学研究和生物技术开发
引人随机突变。(4)利用 Taq 聚合酶的错配倾向，通
领域有极为广泛的应用，目前己有多种有效的方法 进行定位突变。但在很多情况下，对所涉及基因的功 能结构缺乏足够的了解，无法确定突变的部位和性
质，需采取随机突变的方法。随着各种高通量筛选技
过错配 PCR 引人随机突变。近来抗体库技术的进展
Yan 祷 CCentral
Laboratory , Navy General Hospital of PLA , Beijing 100037 , China)
Objective: To evaluate the effectiveness of random mutagenesis via mutator E. coli strain and error-prone
个循环)突变率可 >2% 。其突变类型有明显偏向性，以 A/T 的突变为主，转换多于颠换。结抢:用致突菌株引入的突变率过 低，不适用于抗体亲和力成熟，错配 PCR 在合适条件下可达到 2% 以上突变率，适用于随机突变抗体库的构建，但其突变类型
有偏向性，应予以考虑。 [关键词] 聚合酶链反应;突变;致突菌株 ;ScFv
物引人随机突变，此法受合成技术的限制，只适用于 100 个碱基以下的基因。 (2) 用化学致突剂引人随机
突变，这一方法引人的突变频率较低，且不完全随
抗体库，我们对这两种随机突变方法进行了评估。
1
1. 1
材料和方法
材料
抗 HBsAg 单链抗体 (ScFv) 表达载体
[基金项目]
全军"十五"医药科研规划重点课题 (01Z015).
1. 5 mmo l/L 、 dNTP 各 0.2
0
各随机取 2 个克隆测序，结果在 2. 5 mmo l/ L Mg 2+
组中， 1 轮扩增的突变率为 0.66%(8/121 7)， 2 轮为
mmol/L 、 Taq 聚合酶 5 U
PCR 程序: 94"C 变性 1
mln 、 45'C 退火 1 min 、 72"C 延伸 1 min ，共 30 循环， 最后一循环 72"C 延伸 5 min 。
[作者简介]
陈晓穗(1 954少，女(汉族) ，硕士，副研究员.
机。 (3) 使用致突菌株，通过将基因在该菌株中传代
份 Corresponding
author. E-mail .wangy@95777.com
• 308 •
pHBSC 为我室构建，致突变菌株 X L1 -Red 的感受
第二军医大学学报
仅发现 1 个点突变，突变率为 0.07% 。
LB 中 0/100 稀释) ，继续 3TC 震荡培养过夜，如此
重复 7 次，取少量菌液涂 Amp-LB 板， 37'C 培养过
2.2.2
Mg 2+浓度对 PCR 错配的影响
在错配
PCR 中，我们在反应体系中加入了 0.5 mmo l/L 的
夜后随机挑取克隆，提取质粒测定 DNA 序列。
转种传代 7 d ，选取克隆测定 DNA 序列 o 用错配 PCR 在相同基因中引入突变，比较不同 Mg2+浓度、不同 dNTP 的浓度、不同
dITP 等条件下所致突变率。结泉:在 XLl -Red 菌株中转种 7 dC 约 50 代)后，测定突变率 <0.1% 。在错配 PCR 中，增加 Mg2+
PCR. Methods: A ScFv containing phagemid was transformed into mutator strain XL1-Red and subjected to 7 overnight growth phases with 1/100 dilution of each phase. DNA was extracted and sequenced. The ScFv gene was also subjected to PCR mutagenesis. Mutation effects of Mg 2+ concentration , alteration of individual dNTP amounts and addition of dITP were investigated. Results: The mutation rate of 7 growth phases Cabout 50 cell cycles) in XL1-Red was less than 0.1%. In errorprone PCR , higher concentration of Mg 2+ increased the mutation rate. Increased content of dTTP and dCTP had better effect than that of dATP and dGTP. Addition of dITP plus low concentration dATP or dGTP caused lower mutation rate. More than 2 % mutation could be reached by 2 rounds PCR containing 5 mmo l/L MgCI 2 , O. 5 mmo l/L MnCI 2 , 1 mmo l/L dTTP and 1 mmo l/L dCTP. But the mutation showed obvious base bias with most substitutions at A/T positions and a prevalence of transition over transversion. Conclusion: Random mutagenesis in mutator strain has too low mutation rate for antibody affinity maturation. A more than 2 % mutation rate can be obtained by error-prone PCR , which is suitable for constructing mutated antibody libraries , but the base bias of error-prone PCR should be considered. [KEY WORDSJ PCR; random mutation; mutator strain; ScFv [Acad J Sec Mil Med Univ , 2003 , 24(3) :307-310J
浓度可提高突变率，增加 dTTP 和 dCTP 浓度的致突变效果优于增加 dATP 和 dGTP 的效果。在 dITP 配以低浓度的 dATP
或 dGTP 时突变率较低，使用 5 mmol/L MgCl 2 、 O. 5 mmol/L MnCl 2 、 1 mmo l/ L dTTP 和 dCTP 的条件下，经 2 轮 PCRC 共 60
下述多种反应条件及不同条件的组合: (1)增加
2.2.3
MnC1 2 ; (2) 分别试用了几种 MgC1 2 浓度 : 2.5 、 5.0 、 7.5 mmol/L; (3) 分别试用了两组增高的 dNTP 浓
度(至 1 mmol/L): dTTP 和 dCTP 为一组， dATP
和 dGTP 为另一组 ;(4) 在常规 PCR 的基础上，加入
变，说明 7 轮传代后的 ln VlVO 突变率小于 0.1% 。
2.2 2.2.1
PCR 错配引入突变的影响因素
1. 2
致突菌株的突变
用 pHBSC 质粒按厂家提
常规 PCR 的突变率
我们首先观察了正常
供的操作程序转化 XL1 -Red 细菌，铺氨节青霉素
条件下 PCR 的突变率，按实验方法中的条件进行 1
2. 2. 4
应用 dITP 的突变效果
Spee 等 [3] 曾报道
在 PCR 反应体系中加入 0.2 mmo l/ L 的 dITP 并减 少一种 dNTP 的浓度可增加 PCR 所产生的突变，我
1. 4
PCR 引入突变的鉴定
PCR 产物以琼脂糖电
们对这一方法进行了评估。按照 Spee 的条件，使用
2003 年 3 月，第 24 卷
挑取第 2 天和第 7 天各 2 个克隆，共测定了 2 500
个碱基的序列，与原 ScFv 序列比较，未见一个突
态细胞购自 Stratagene 公司，克隆 PCR 产物的
pGEM-T 载体系统和 Taq 聚合酶购自 Promega 公 司， dNTP 和 dITP 购自 Roche 公司。
dTTP 和 dCTP 的浓度换成增高 dATP 和 dGTP 的 浓度，其他同上述高浓度 Mg 2+的 PCR 条件，经 1 个
循环 PCR 后选 2 个克隆测序，结果突变率为 0.6%
(8/1 322) ，低于增高 dTTP 和 dCTP 的浓度，其突
变类型相似。
dITP ，同时将 dATP 或 dGTP 降至常规量的 1/10 ， 即 0.02 mmo l/ L; (5) 将上述"改变离子浓度和 dNTP 浓度"和"使用 dITP"两种方法以序贯方式或 合用方式联合应用。
使人们可以在体外进行抗体分子的亲和力成熟，对 抗体基因进行有效的随机突变是这一过程的重要步 骤，有人应用后两种随机突变技术取得了一定成
效口 .2J 。为了选择确定有效的随机突变方法构建突变
术的发展(如抗体库技术) ，应用随机突变技术构建
突变体文库，选择具有特定功能或功能得到改善的
变种已得到越来越广泛的应用。但迄今仍然缺乏可 获得较高突变频率的理想随机突变方法。 现有的随机突变方法包括:(1)人工合成兼并引
[中图分类号 J
Q 784
C文献标识码 J
A
[文章编号 J
0258-879X(2003)03-0307-04
The condition for error-prone PCR induced mutation CHEN Xiao-Sui , WANG Bao-An , WANG [ABSTRACTJ
第二军医大学学报
Acad J Sec Mil Med Univ
," VV0
2003 m <H, 24(3) Mar
,
,"'r\ 0/
•
307 •
·伦著·
错配 PCR 致突变的实验条件研究
陈晓穗，汪保安，王 [摘要] 2支骨(中国人民解放军海军总医院中心实验科，北京 100037)
甸的:对目前常用的致突菌株和 PCR 随机突变方法进行评价。方战:用单链抗体表达质粒转化致突菌株 XLl -Red ，
1. 35 % 08/1 33 7);而 5.0 mmo l/ L Mg 2+组的 1 、 2
轮突变率分别为 2. 4% (34/1 422) 和 2.8%
(3 3/1 178) ，可见提高 Mg 2+浓度可增加突变率。 增高不同的 dNTP 浓度的影响 将增高
1. 3. 2
错配 PCR
在常规 PCR 的基础上，尝试了