现代仪器分析-高效毛细管电泳法在药物分析中的应用(chaj)
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
现代仪器分析
第一讲: 高效毛细管电泳法
在药物分析中的应用
College of Pharmacy, Shanxi Medical University Prof. Anjia CHEN
2017/10/8 1
第一节 仪器分析法概述 (generalization)
色谱分析法 √
光谱分析法 √
仪器分析法
蛋白质、DNA等由于其电荷/质量比与分子大小无关，CZE模 式很难将其分离；而采用CGE能获得良好分离。它是DNA测序 的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分辨率极高。
无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物分子在溶液中的物
理缠扰作用代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。
2017/10/8
19
电化学分析法
质谱分析法
2017/10/8 2
其他仪器分析法有：
流动注射分析 (Flow Injection Analysis, 热分析 (Thermal Analysis, TA) X射线分析 (X-ray Analysis)
FIA)
…
2017/10/8 3
第二节 HPCE基本知识回顾
带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的
矢量和。
2017/10/8 5
高效毛细管电泳技术上的重要突破
高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了25~75µ m内径的毛细管； 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大 减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变 小，柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理 论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数 百万甚至数千万。
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（4）毛细管等电聚焦 （Capillary Isoelectric Focusing, CIEF） 是一种根据等电点的差别分离生物大分子的 电泳技术。两性物质以电中性状态存在时的pH值 称为等电点，用pI表示。将被分离的物质和两性 电解质混合物装入毛细管，在电场作用下，不同 等电点的两性载体电解质沿毛细管自动形成pH梯 度，被分离的两性物质各自迁移至其等电点，形 成很窄的区带，分辨率很高。
定相和流动相之间分配平衡常数的不同和电泳速
率的不同而达到彼此分离的目的。
2017/10/8 24
毛细管电色谱作为HPLC和CE的融合技术，主要有 以下特点：
（1）采用电渗流EOF驱动（下图），EOF的柱塞流型较HPLC 的抛物线流型可以达到更高的柱效。
（2）具有色谱和电泳的双重分离机理和选择性，既可分离中 性分子，也可分离带电分子。
CZE只能分析带有电荷的离子而不能分离中性
物质，是最基本、最普遍的一种分离模式。
2017/10/8 9
CZE中背景电解质的浓度一般高于试样，起运
载电流的作用，其离子有一定的迁移率。当电流通
过时，缓冲溶液中的阴、阳离子以一特定的速度分
别向正极和负极移动。同时试样中的不同离子将按
各自的恒定速度移动，形成背景电解质离子流动中 伴随有试样离子的流动。如果试样中不同离子的迁 移率差别很大，就能将不同离子分离。
Cyclodextrins - Solubilizer for very hydrophobic samples, chiralanalyte discriminator
14
2017/10/8
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（2）胶束电动毛细管色谱（MECC or MEKC）
（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography)
23
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（6）毛细管电色谱（ CEC ） （Capillary Electroosmotic Chromatography） 把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的 一种分离技术。在毛细管中填充或在毛细管内壁
涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流推动流动相，
使中性和带有电荷的样品分子根据它们在色谱固
毛细管柱和电渗流示意图
2017/10/8 26
三、毛细管电泳的主要优点
较高灵敏度(检测器相关) 高分离效率 高速度 （一般不超过 20min，有的仅需几十秒钟） 所需样品量少
* zwitterionic buffer 2017/10/8
*From Landers, Handbook of Capillary Electrophoresis, 2nd Ed., CRC Press(1997)
Buffer Modifiers (改性剂 )for CZE
Organic Solvent – Solubilizer (增溶剂), EOF modifier (ex. methanol, acetonitrile, ethylene glycol (乙二醇) ) Divalent Amine (二胺)- EOF Modifier/charge modifier (ex. Diaminopropane (丙二胺)) Sulfonic Acids (磺酸) - Ion-pairing (ex. Hexane SA 己烷磺酸) Urea - Biomolecule denaturant/solubilizer (生物分子变性剂/增溶剂) Cationic Surfactant - EOF Reversal (ex. DTAB,CTAB) (Note: high conc=micellar phase[MEKC]) Cellulose (纤维素) - EOF Modifier, Sieving Medium (ex. methyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose)
2017/10/8 21
4. 聚焦Fra Baidu bibliotek具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁
移，分别到达满足其等电点pH的位臵时，呈电中性，停
止移动，形成窄溶质带而相互分离； 5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液； 6. 加压(力)将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7. 电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。
2017/10/8
22
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（5）亲和毛细管电泳 (Affinity capillary electrophoresis, ACE) 在毛细管内涂层或在凝胶在中加入亲和配 基，以亲和力的不同达到分离目的。可用于研 究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。
2017/10/8
2017/10/8
16
电泳流和电渗流的方向相反，且u电渗流 ＞u电泳 ，负电胶束 以较慢的速度向负极移动；
中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的 组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
2017/10/8
17
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（3）毛细管凝胶电泳
（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）
13
Phosphate Formate Acetate MES* (2-(N-吗啉)乙磺酸介绍) Citrate (柠檬酸盐 ) PIPES (哌嗪-N,N-二(2-乙磺酸) ) Phosphate HEPES* (羟乙基哌嗪乙硫磺酸) Tricine*(三(羟甲基)甲基甘氨酸) Tris (三羟甲基氨基甲烷 ） Borate (硼酸盐) CAPS* (3-(环己胺)-1-丙磺酸钠) (两性离子缓冲液 )
毛细管电泳(CE: Capillary Electrophoresis)又称高
效毛细管电泳(HPCE),是指离子或带电粒子以弹性石 英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依 据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实 现分离的液相分离分析技术。
HPCE: 以内径10~200µm的毛细管柱为分离通道，
2017/10/8
10
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。
正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；
中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反； u电渗流 ＞u电泳时,阴离子在负极最后
流出,在这种情况下,不但可以按类
分离,同种类离子由于差速迁移被 相互分离。
（3）毛细管电色谱中没有反压问题，可以使用更小粒度的填 料和更长的毛细管柱，因而具有更高的分辨能力。 （4）在分离中性粒子时，毛细管电色谱不需要像胶束电动力 学色谱那样使用表面活性剂，有利于和质谱方法（MS）的 联用。
2017/10/8 25
（5）由于毛细管电色谱中所用的毛细管柱内径小，与传统的 HPLC相比，其溶剂和样品量只是后者的万分之一，这种对溶 剂和样品的巨大节约，使毛细管电色谱十分经济，也更符合 环保要求。
在缓冲溶液中加入大于临界胶束浓度(CMC)
的表面活性剂。胶束相在分离中起准固定相的作用，
将电泳与分配色谱相结合，既可以分离离子型化合
物，也可以分离中性化合物。
2017/10/8
15
缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓 度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的 作用下，胶束在柱中移动。
2017/10/8 11
Buffer Considerations
1. 2. 3. 4.
Typical [buffer]: 25-200mM Good buffering capacity within the desired range Minimal UV absorbance（低紫外吸收） Low conductivity if possible (低电导)
5.
Inexpensive/available (廉价/有效)
2017/10/8
12
Typical Buffer Systems/FSCE(CZE)
BUFFER
Useful pH Range
1.1-3.1 2.8-4.8 3.8-5.8 5.2-7.2 5.4-7.4 5.8-7.8 6.2-8.2 6.6-8.6 7.2-9.2 7.3-9.3 8.1-10.1 9.7-11.7
非水相毛细管电泳（NACE）
2017/10/8 8
几种常用的毛细管电泳分离模式
（1）毛细管区带电泳 （Capillary Zone Electrophoresis, CZE=FSCE） 是指溶质在毛细管内均一的背景电解质缓冲溶 液中以不同速率迁移而形成彼此分离的溶质带的电
泳模式，分离的基础是淌度的差别。
对大分子和小分子等进行高效分离和检测的有关技
术的统称。
2017/10/8 4
一、HPCE原理
分离的原因：电泳迁移，电渗迁移
电泳迁移：在高压电场下，样本中各带电离子依据其所带
电荷的性质、多少及大小、形状的不同向相反方向移动。
电渗迁移：电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁
移动的现象。当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的 硅羟基发生解离，生成的氢离子溶解在溶液中，这样就使 毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层，在毛细管的两端 加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动， 这就形成了电渗流。
在毛细管内填充多孔性凝胶或其它筛分
介质，将电泳和凝胶色谱分离模式相结合，可
用于生物大分子的分析，如蛋白质和 DNA 的
分子量和碱基数的测定。
2017/10/8
18
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。
凝胶具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。
能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。
2017/10/8 20
1. CIEF是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技 术； 2. 毛细管内充有两性电解质(合成的具有不同等电点范围的 脂肪族多胺基多羧酸混合物)，当施加直流电压（6～8V） 时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等所带电荷与溶液pH有关，在酸 性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈 电中性，淌度为零；
2017/10/8 6
毛细管电泳原理示意图
2017/10/8
7
二、毛细管电泳的主要模式
毛细管区带电泳（CZE） 毛细管凝胶电泳（CGE）
毛细管等电聚焦（CIEF）
毛细管电动色谱（ MECC; MEEKC etc.） 毛细管电色谱（CEC） 毛细管等速电泳（CITP） 亲和毛细管电泳（ACE）
第一讲: 高效毛细管电泳法
在药物分析中的应用
College of Pharmacy, Shanxi Medical University Prof. Anjia CHEN
2017/10/8 1
第一节 仪器分析法概述 (generalization)
色谱分析法 √
光谱分析法 √
仪器分析法
蛋白质、DNA等由于其电荷/质量比与分子大小无关，CZE模 式很难将其分离；而采用CGE能获得良好分离。它是DNA测序 的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分辨率极高。
无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物分子在溶液中的物
理缠扰作用代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。
2017/10/8
19
电化学分析法
质谱分析法
2017/10/8 2
其他仪器分析法有：
流动注射分析 (Flow Injection Analysis, 热分析 (Thermal Analysis, TA) X射线分析 (X-ray Analysis)
FIA)
…
2017/10/8 3
第二节 HPCE基本知识回顾
带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的
矢量和。
2017/10/8 5
高效毛细管电泳技术上的重要突破
高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了25~75µ m内径的毛细管； 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大 减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变 小，柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理 论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数 百万甚至数千万。
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（4）毛细管等电聚焦 （Capillary Isoelectric Focusing, CIEF） 是一种根据等电点的差别分离生物大分子的 电泳技术。两性物质以电中性状态存在时的pH值 称为等电点，用pI表示。将被分离的物质和两性 电解质混合物装入毛细管，在电场作用下，不同 等电点的两性载体电解质沿毛细管自动形成pH梯 度，被分离的两性物质各自迁移至其等电点，形 成很窄的区带，分辨率很高。
定相和流动相之间分配平衡常数的不同和电泳速
率的不同而达到彼此分离的目的。
2017/10/8 24
毛细管电色谱作为HPLC和CE的融合技术，主要有 以下特点：
（1）采用电渗流EOF驱动（下图），EOF的柱塞流型较HPLC 的抛物线流型可以达到更高的柱效。
（2）具有色谱和电泳的双重分离机理和选择性，既可分离中 性分子，也可分离带电分子。
CZE只能分析带有电荷的离子而不能分离中性
物质，是最基本、最普遍的一种分离模式。
2017/10/8 9
CZE中背景电解质的浓度一般高于试样，起运
载电流的作用，其离子有一定的迁移率。当电流通
过时，缓冲溶液中的阴、阳离子以一特定的速度分
别向正极和负极移动。同时试样中的不同离子将按
各自的恒定速度移动，形成背景电解质离子流动中 伴随有试样离子的流动。如果试样中不同离子的迁 移率差别很大，就能将不同离子分离。
Cyclodextrins - Solubilizer for very hydrophobic samples, chiralanalyte discriminator
14
2017/10/8
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（2）胶束电动毛细管色谱（MECC or MEKC）
（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography)
23
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（6）毛细管电色谱（ CEC ） （Capillary Electroosmotic Chromatography） 把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的 一种分离技术。在毛细管中填充或在毛细管内壁
涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流推动流动相，
使中性和带有电荷的样品分子根据它们在色谱固
毛细管柱和电渗流示意图
2017/10/8 26
三、毛细管电泳的主要优点
较高灵敏度(检测器相关) 高分离效率 高速度 （一般不超过 20min，有的仅需几十秒钟） 所需样品量少
* zwitterionic buffer 2017/10/8
*From Landers, Handbook of Capillary Electrophoresis, 2nd Ed., CRC Press(1997)
Buffer Modifiers (改性剂 )for CZE
Organic Solvent – Solubilizer (增溶剂), EOF modifier (ex. methanol, acetonitrile, ethylene glycol (乙二醇) ) Divalent Amine (二胺)- EOF Modifier/charge modifier (ex. Diaminopropane (丙二胺)) Sulfonic Acids (磺酸) - Ion-pairing (ex. Hexane SA 己烷磺酸) Urea - Biomolecule denaturant/solubilizer (生物分子变性剂/增溶剂) Cationic Surfactant - EOF Reversal (ex. DTAB,CTAB) (Note: high conc=micellar phase[MEKC]) Cellulose (纤维素) - EOF Modifier, Sieving Medium (ex. methyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose)
2017/10/8 21
4. 聚焦Fra Baidu bibliotek具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁
移，分别到达满足其等电点pH的位臵时，呈电中性，停
止移动，形成窄溶质带而相互分离； 5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液； 6. 加压(力)将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7. 电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。
2017/10/8
22
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（5）亲和毛细管电泳 (Affinity capillary electrophoresis, ACE) 在毛细管内涂层或在凝胶在中加入亲和配 基，以亲和力的不同达到分离目的。可用于研 究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。
2017/10/8
2017/10/8
16
电泳流和电渗流的方向相反，且u电渗流 ＞u电泳 ，负电胶束 以较慢的速度向负极移动；
中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的 组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
2017/10/8
17
毛细管电泳的几种分离模式 (续)
（3）毛细管凝胶电泳
（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）
13
Phosphate Formate Acetate MES* (2-(N-吗啉)乙磺酸介绍) Citrate (柠檬酸盐 ) PIPES (哌嗪-N,N-二(2-乙磺酸) ) Phosphate HEPES* (羟乙基哌嗪乙硫磺酸) Tricine*(三(羟甲基)甲基甘氨酸) Tris (三羟甲基氨基甲烷 ） Borate (硼酸盐) CAPS* (3-(环己胺)-1-丙磺酸钠) (两性离子缓冲液 )
毛细管电泳(CE: Capillary Electrophoresis)又称高
效毛细管电泳(HPCE),是指离子或带电粒子以弹性石 英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依 据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实 现分离的液相分离分析技术。
HPCE: 以内径10~200µm的毛细管柱为分离通道，
2017/10/8
10
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。
正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；
中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反； u电渗流 ＞u电泳时,阴离子在负极最后
流出,在这种情况下,不但可以按类
分离,同种类离子由于差速迁移被 相互分离。
（3）毛细管电色谱中没有反压问题，可以使用更小粒度的填 料和更长的毛细管柱，因而具有更高的分辨能力。 （4）在分离中性粒子时，毛细管电色谱不需要像胶束电动力 学色谱那样使用表面活性剂，有利于和质谱方法（MS）的 联用。
2017/10/8 25
（5）由于毛细管电色谱中所用的毛细管柱内径小，与传统的 HPLC相比，其溶剂和样品量只是后者的万分之一，这种对溶 剂和样品的巨大节约，使毛细管电色谱十分经济，也更符合 环保要求。
在缓冲溶液中加入大于临界胶束浓度(CMC)
的表面活性剂。胶束相在分离中起准固定相的作用，
将电泳与分配色谱相结合，既可以分离离子型化合
物，也可以分离中性化合物。
2017/10/8
15
缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓 度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的 作用下，胶束在柱中移动。
2017/10/8 11
Buffer Considerations
1. 2. 3. 4.
Typical [buffer]: 25-200mM Good buffering capacity within the desired range Minimal UV absorbance（低紫外吸收） Low conductivity if possible (低电导)
5.
Inexpensive/available (廉价/有效)
2017/10/8
12
Typical Buffer Systems/FSCE(CZE)
BUFFER
Useful pH Range
1.1-3.1 2.8-4.8 3.8-5.8 5.2-7.2 5.4-7.4 5.8-7.8 6.2-8.2 6.6-8.6 7.2-9.2 7.3-9.3 8.1-10.1 9.7-11.7
非水相毛细管电泳（NACE）
2017/10/8 8
几种常用的毛细管电泳分离模式
（1）毛细管区带电泳 （Capillary Zone Electrophoresis, CZE=FSCE） 是指溶质在毛细管内均一的背景电解质缓冲溶 液中以不同速率迁移而形成彼此分离的溶质带的电
泳模式，分离的基础是淌度的差别。
对大分子和小分子等进行高效分离和检测的有关技
术的统称。
2017/10/8 4
一、HPCE原理
分离的原因：电泳迁移，电渗迁移
电泳迁移：在高压电场下，样本中各带电离子依据其所带
电荷的性质、多少及大小、形状的不同向相反方向移动。
电渗迁移：电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁
移动的现象。当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的 硅羟基发生解离，生成的氢离子溶解在溶液中，这样就使 毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层，在毛细管的两端 加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动， 这就形成了电渗流。
在毛细管内填充多孔性凝胶或其它筛分
介质，将电泳和凝胶色谱分离模式相结合，可
用于生物大分子的分析，如蛋白质和 DNA 的
分子量和碱基数的测定。
2017/10/8
18
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。
凝胶具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。
能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。
2017/10/8 20
1. CIEF是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技 术； 2. 毛细管内充有两性电解质(合成的具有不同等电点范围的 脂肪族多胺基多羧酸混合物)，当施加直流电压（6～8V） 时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等所带电荷与溶液pH有关，在酸 性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈 电中性，淌度为零；
2017/10/8 6
毛细管电泳原理示意图
2017/10/8
7
二、毛细管电泳的主要模式
毛细管区带电泳（CZE） 毛细管凝胶电泳（CGE）
毛细管等电聚焦（CIEF）
毛细管电动色谱（ MECC; MEEKC etc.） 毛细管电色谱（CEC） 毛细管等速电泳（CITP） 亲和毛细管电泳（ACE）