耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制及检测

#综述#耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制及检测

朱以军综述李向阳审校

=摘要>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA)是医院内感染和社区感染的重要病原菌之一,其

检出率逐年增高,耐药性不断增强,对临床治疗提出严峻挑战。阐明M R SA的耐药机制以及快速准

确地检测M RSA是预防和控制M RSA感染的基础和重要环节,也是当前M RSA研究的热点。现就

M RSA的耐药机制及其检测方法的研究进展作一综述。

=关键词>甲氧西林抗药性;葡萄球菌,金黄色;基因,细菌;抗药性,微生物

自从1961年Jevons首次分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylo coccus au-r eus,MRSA)以来,MRSA在世界各地感染率和分离率不断增加,已成为目前医院内感染的重要病原菌之一。在美国,M RSA占院内感染分离的金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的比率从1987年的14.3%上升到1997年的39.7%[1]。李家泰等[2]监测表明,我国MRSA检出率为27.55%,而医院内感染(ho spital in-fections,H I)患者中M RSA检出率显著高于社区感染(co mmunity-acquired infections,CAI)患者。1996年日本首先发现对万古霉素敏感性降低的金黄色葡萄球菌(vancom ycin intermediate staphylo coccus au-r eus,V ISA)。随后,美国、英国、德国、意大利等国也陆续报道了VISA,给M RSA感染的临床治疗带来严峻挑战。目前,M RSA感染与乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)同时列为世界上最难解决的三大感染性顽症。因此,从基因水平阐明MRSA的耐药机制,快速准确地检测M RSA对其感染的控制有重要意义。现就M RSA的耐药机制及检测方法作一简要综述。

M RSA的耐药机制

1.MRSA的耐药决定因子)))m ec基因:MR-SA的染色体上携带有一个甲氧西林敏感金葡菌(M SSA)所不具备的甲氧西林耐药决定因子)))m ec 基因,其大小为30~50kb,为一段外源性的插入片段,通常位于pur-nov-his基因群附近。m ec基因包括mecA基因、mecI和mecR1基因以及mec相关基因。mecA基因长约

2.13kb,编码产生78@103的青霉素结合蛋白(penicillin-binding protein,PBP)2a,其基因序列具有细胞壁合成转肽酶基因结构特征。

mecI和mecR1是调控m ecA转录的一对调节基因,位于mecA启动子上游。通常情况下,mecI编码产生的M ecI蛋白结合在m ec基因的启动子部位,使mecA基因不能被转录。当诱导物存在时,m ecR1基因编码产生的MecR1蛋白能够去除MecI蛋白对mecA的阻遏作用,去阻遏的mecA经RNA多聚酶转录、翻译产生PBP2a。mecI和m ecR1的结构、功能和调节机制与B-内酰胺酶调控组件(blaI和blaR1)相似。BlaI是阻遏B-内酰胺酶基因转录的DNA结合蛋白,BlaRI则在B-内酰胺类抗生素存在时诱导B-内酰胺酶基因转录,产生B-内酰胺酶。有学者提出,mecA 基因是PBP基因和B-内酰胺酶基因的同源性重组产物[3]。因此,m ecA可受B-内酰胺酶调控组件blaI和blaR1的共同调节。但m ecR1-mecI对mecA的调节作用比blaR1-blaI强。

mecA、mecR1和mecI整合在20~45kb的mec 相关基因中,这些基因包括IS431、T n554、pUB110和pT181等。它们编码产生对非B-内酰胺类抗生素的耐药因子,导致MRSA的多重性耐药。其中T n554位于m ecA的5c端,包含编码红霉素耐药的ermA基因。IS431则位于m ecA的3c端,由于缺失、重排、重组的发生,它与mecA基因间的距离变化很大,IS431是葡萄球菌染色体和质粒极普遍的插入序列,与四环素耐药有关[4]。

mec基因的起源尚未完全阐明,有证据表明,金葡菌的SCC m ec基因(staphylococcal chro mosome cassette m ec)可能来源于凝固酶阴性的葡萄球菌,如松鼠葡萄球菌携带的m ecA基因[5]。目前,关于MR-SA的起源有两种假说[6]:一种是单克隆假说,该假说是在对早期MRSA的m ecA基因和T n554基因进行的限制性片段长度多态性分析的基础上提出的,认为mecA是很偶然地进入金葡菌并以单一的M RSA克隆形式在世界各地蔓延;但有不少学者对该学说提出质疑,因为有资料表明mecA基因能反复地水平传播给8种以上金葡菌家系,在抗生素的选择压力下有更多的耐药克隆被传播。第二种假说通过多位点酶电泳分型检测mecA,认为M RSA的mecA基因是经过水平传播、长时间的演变而进入不同种系的MSSA 中,使用DNA芯片技术已检测出至少5种以上的分

作者单位:325027浙江,温州医学院附属第二医院检验科

散家系,说明mecA的水平传播扮演重要角色。最近在体内观察到mecA基因从表皮葡萄球菌向金葡菌传播,表明m ecA可以频繁地传给M SSA。

影响mecA基因表达的辅助基因

虽然完整的mecA基因是M RSA对甲氧西林高度耐药的表达所必需,但单纯的mecA基因及其产物PBP2a并不能完全解释M RSA对甲氧西林的耐药性。有研究表明,虽然MRSA可产生相同的PBP2a,但对甲氧西林的敏感性可相差很大,说明PBP2a的量与M RSA耐药水平的高低即M IC并无相关性。实验研究结果显示,在细菌染色体上有表达甲氧西林耐药的必需因子,即fem(factor essential fo r methicillin resistance)或称为aux因子(auxiliary factors)。目前已被识别的fem有6种,分别命名为femA、femB、femC、femD、femE和femF。fem A和femB的基因失活均可导致MRSA对甲氧西林的敏感性水平明显提高,但PBP2a和其他PBP的产生不受影响。fem C的失活也可降低细菌对甲氧西林的耐药水平,但对异质性耐药性的表达没有影响。fem D的失活虽可增高细菌对甲氧西林的敏感性,但高水平的同构型耐药仍可表达。fem E的功能至今尚未阐明,femF的突变可导致细菌表达异质性耐药。

影响mecA表达的其他染色体位点

llm基因可编码38kD的疏水性蛋白,llm灭活后,均质性耐药的菌株可变为异质性耐药的菌株[4]。

ag r(accessory gene reg ulator)位点和sar (staphy loco ccal accessory regulator)位点的失活能使异质性菌株的菌量轻度减少。PBP2a产量没有改变但PBP1和PBP3的数量减少,这可能与细菌耐药性表达有关[4]。

M RSA的耐药机制

MRSA的耐药机制非常复杂,但主要的机制是其染色体上产生了一个额外的PBP,即PBP2a所致。PBPs是一组位于细菌内膜,具有催化活性的D肽酶,催化细菌细胞壁肽聚糖的转肽反应,这种转肽酶活性为维持细菌细胞壁的结构完整所必需。普通的金葡菌可产生4种主要的PBPs:PBP1、PBP2、PBP3和PBP4。PBP1、2、3均为转肽酶,为细菌生存所必需, PBP4则具有转肽酶和羧肽酶的双重活性。这些PB-Ps与多数B-内酰胺抗生素都有高亲和力,是该药物主要的作用靶点。当药物浓度达到M IC时,PBPs失活导致细菌的细胞壁合成障碍,细菌无法生存。而MR-SA染色体上m ecA基因编码产生的PBP2a对B-内酰胺抗生素的亲和力很低,并能替代原来正常PBPs的生物合成功能,从而使细菌得以生存,表现为对抗生素的耐药。

PBP2a的表达除受调控基因的调节外,也受多种外界因素的影响,如温度、pH和渗透压等。有实验研究表明,温度在30~35e、pH7.0~7.2、盐浓度为4%时PBP2a的产量最高。因此,对于表型敏感但染色体上携带mecA基因的细菌应视为耐甲氧西林菌株。

导致M RSA耐药的另一原因是正常PBPs基因修饰或B-内酰胺酶的过量产生。在抗生素选择压力下原有产生PBPs的基因发生突变,导致这些PBPs 与B-内酰胺抗生素的亲和力下降而表现为耐药。另外,大量产生的B-内酰胺酶能微弱水解包括甲氧西林在内的耐青霉素酶及头孢菌素,使抗生素失活而表现为耐药。但这些原因引起的耐药往往表现为低水平或临界性的耐药,所占比例极少,临床意义不大。

M RSA的耐药特点

11M RSA耐药的导质性:MRSA对B-内酰胺抗生素的高度耐药性有同构型(hom ogeneo usly)或异质性(heter ogeneo usly)耐药两种。同构型耐药的菌株表现为所有菌细胞均高度耐药,呈单一群体。异质性耐药菌株则在同一群体中包括两个或两个以上耐药程度不同的亚群体,仅有极少数细菌(10-4~10-7)对抗生素高度耐药,大部分(通常为9919%或更高)则表现为低度耐药。绝大多数临床分离株在常规培养条件下表现为异质性耐药。改变培养条件(如添加NaCl或蔗糖的高渗培养基或30e培养)可使高度耐药菌增加而表现为同构型耐药。此外,异质性耐药菌株在含B-内酰胺抗生素的培养基中多次传种后可通过高耐药突变克隆而改变其耐药表现,表现为同构型耐药。而在无抗生素的培养基中,高耐药菌株可逐渐消失而重新转变为异质性耐药菌株。

21M RSA耐药的多重性:几乎所有M RSA都是多重耐药菌,对B-内酰胺类抗生素,如青霉素类和头孢菌素类均不敏感,对氯霉素、庆大霉素、林可霉素、氨基糖甙类、环丙沙星、四环素类和大环内酯类抗生素的敏感性很低,对氟喹诺酮类药的耐药率也迅速增高。

M RSA的检测方法

11M RSA的表型检测:常用的表型检测法有:KB 纸片扩散法、肉汤稀释法、E试验法和琼脂筛选法。由于细菌耐药表型的表达与各种生长条件(如温度、pH和培养基的渗透压等)密切相关,使得这些药敏试验存在实验条件的标准化问题[4]。美国实验室标准化委员会(NCCLS)对实验的条件、质量控制和结果的判断都作了规定。Cavassini等[7]的研究表明,纸片扩散法的特异性为9617%,而敏感性只有6113%。琼脂筛选法、肉汤稀释法都是可靠的检测法,与其他表型检测法相比有很高的特异性和敏感性,因此被NC-CLS列为参考方法。Sakoulas G等[1]研究表明,琼脂