蛋白变性

核酸抽提纯化的步骤

- 纯化步骤

核酸纯化的经典手段相对是比较统一的，而且目的也非常明确：去除除目的核酸外的一切杂质。一般的纯化步骤，按先后次序，依次是去除蛋白质、去除小分子盐、去除乙醇。

最常用去除蛋白质的经典方法，一是苯酚/氯仿抽提，二是高盐沉淀。

一、苯酚/氯仿抽提，是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。苯酚/氯仿抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。苯酚/氯仿抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用苯酚/氯仿抽提的，否则核酸必定降解。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。

二、高盐沉淀，同样是一个非常不错的去除蛋白质的方法。如果将裂解看成是一个 Salt-in (盐促进核酸溶入液体体系) 过程，高盐沉淀则是一个 Salt-out (盐促进蛋白质从液体体系析出) 过程。最常用的搭配是：SDS 用于裂解，KAc 用于沉淀蛋白质。与苯酚/氯仿抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了苯酚/氯仿抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。

核酸沉淀是核酸由溶解于液体中变成不溶解于液体中的过程。该过程可以实现核酸与仍然溶解于液体中的物质的分离，所以，本质上，核酸沉淀也属于核酸纯化范畴。

醇沉淀，是经典核酸抽提技术中去除小分子盐的最常用手段。对大多数样品，沉淀时无论是使用 2 倍体积的无水乙醇，还是 1 倍体积的异丙醇，核酸沉淀的速度和效率都可以满足要求。另外，醇沉淀的核酸，洗涤过程也相对简单。不过，醇沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。

LiCl 沉淀、PEG 沉淀，是经典核酸抽提技术中比较特殊的沉淀方法。虽然它们远没有醇沉淀那么高的使用频率，但却各有特点：LiCl 可以沉淀大分子 RNA 以去除 DNA 和小分子 RNA，PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。使用它们的目的非常明确，就是醇沉淀方法不能满足某些特别的要求。LiCl 沉淀特别使用在含多糖的RNA 抽提过程，它是一种选择性的沉淀方法。这些沉淀方法的最大问题，是洗涤过程难以方便去除；所以多数情况下，使用这些沉淀方法沉淀的的核酸，后面多采用溶解后再次醇沉淀的方法进一步纯化。

介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。介质纯化的最显著特点是：利用介质具有选择性吸附核酸的能力，快速实现同步去除蛋白质和小分子盐的目的。

介质纯化可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 (如 Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。

要提醒的是，介质并不是不吸附蛋白质及其它大分子杂质 (如多糖)，而是将它们的残留控制在比较低的水平，对后续实验不产生影响。相对地，苯酚/氯仿抽提，是可以将蛋白质去除得更彻底一些，但对去除其它大分子杂质，经典方法中却没有如此方便的手段。另外，吸附柱纯化的得率在大部分情况下，不会比其它方法高；但对 ug 级以下的微量核酸，得率比经典方法高。