细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达

实验报告

实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达

报告人：张铨合作者：殷悦涵实验日期：2016.4.26

一、实验原理

1. 细胞RNA的提取及鉴定

细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节避免它的污染。评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在

1.7-

2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。

2. RT-PCR检测p53基因的表达

PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用已知序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过多次循环是模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。基本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。

RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞（A549和H1299）中的表达水平。

二、实验材料及设备

材料：肺癌细胞A549（野生型）和H1299（p53缺失型）、p53引物、GAPDH 引物

试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖

耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩

设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温干燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱

三、实验步骤

1. 细胞RNA的提取及鉴定

（一）RNA提取

取1*106个细胞与1.5mlEp管→加0.2ml氯仿摇匀→4℃，12000rpm离心

15min分层→取上层水相入新的Ep管中加入等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min →4℃，12000rpm离心10min，RNA沉淀→弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀→4℃，12000rpm离心5min→弃上清，晾干，用30μl无RNase水溶解沉淀

（二）RNA浓度和纯度测定

取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度

2. RT-PCR检测p53基因的表达

（一）反转录合成cDNA

1.RNA预变性：取一支0.2mlPCR管加入样品RNA2μg，以无水RNase水补足体积至9μl，70℃，10min，立即置于冰上。

2.设置反转录反应体系，向管内加入

混匀。42℃，15min反转录；95℃，5min终止反应。置于冰上。

（二）PCR扩增目的产物

每组做两份模板不同的PCR反应

1.取两只0.2mlPCR管，分别按下表加入试剂（20μl体系，单位：μl）：

2.设置PCR反应参数为：

94℃预变性 5min

94℃变性 30s

58℃退火 30s

72℃延伸 30s

共30个循环

72℃延伸 5min

（三）RT-PCR产物鉴定：

1.配2%琼脂糖凝胶：

琼脂糖 2g

0.5*TBE 100ml 微波加热融化；冷却至60℃左右，加入GoldView(DNA染料) 5μl 混匀，灌胶

2.电泳：

向水平电泳槽中加入0.5*TBE至恰好浸没凝胶约1mm左右

取15μlRT-PCR产物上样，100V电泳20~30min

结果观察：用凝胶成像仪观察并拍摄电泳结果，以DNA分子量标准（marker）为参照，分析PCR产物大小及p53在两种细胞中的表达情况。理论上，A549是p53野生型的细胞，正常表达p53，该样品的PCR产物经电泳后，应在390bp的位置出现扩增条带；而H1299是p53缺失型的细胞，不表达p53，在相应位置没有扩增条带。管家基因GAPDH作为实验的内部参照，在两种细胞中均有表达，电泳后在320bp处出现扩增条带。

四、实验结果

1. 细胞RNA的提取及鉴定

提取到细胞RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计检测其Abs260/Abs280为2.03，浓度为4.3989μg/μl。

2. RT-PCR检测p53基因的表达

五、实验讨论

1. 细胞RNA的提取及鉴定

由于在RNA提取实验中，RNA浓度较高，为4.2μg/μl，导致在取2μg的RNA时，只需取0.5μl的RNA溶液，移液器的精度不高，容易造成误差，因此应将溶液稀释至1μg/μl左右再取2μg的RNA溶液。

Abs260/Abs280为2.02，说明我们组提取的RNA较为纯净，提取步骤操作良好，几乎没有蛋白质的污染，该溶液可以使用到RT-PCR 的实验中。

2. RT-PCR检测p53基因的表达

可以看到我们组A549细胞中在390bp的位置出现扩增条带，H1299在390bp 处没有出现扩增条带，可说明A549细胞中正常表达p53基因，经过RT-PCR扩增后在电泳凝胶成像仪中表现出390bp有扩增条带，H1299细胞则不表达p53，不出现扩增条带。

由于我组实验结果为阴性，所以不能看出在实验步骤中混入RNase降解RNA，但还需在实验步骤中注意佩戴口罩和手套。