毛细管电泳

毛细管电泳

第一部分原理

一、迁移

毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)。

偶电层：固定层和流动液层共同构成了偶电层；固定层和流动液层间的电势差称为Zeta 电势。

Zeta电势的值随距离增大呈指数衰减，使其衰减一个指数单位所需的距离称之为偶电层的厚度，用δ表示。

在溶液中的导电仍然服从欧姆定律，即E=IR，I是电流，R是电阻，E是电场强度。

电泳：是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。

电渗：是指在电场作用下，毛细管内液体沿固体表面移动的现象。

电泳

移动速度：u ep=μep·E；E为电场强度，μep表示溶质的淌度。

溶质的淌度μep：溶质在给定缓冲液中单位时间间隔和单位电场强度下移动的距离。

εζ1

μep=

ε是流体的介电常数；η是介质的粘度；ζ是粒子的Zeta电势；Zeta电势近似正比于Z/M2/3；M为分子量，Z为净电荷。

电渗

当在通道两端施加电压时，距离通道壁较远的正离子（受壁的吸引力较弱，可自由移动）游向负极，正离子带着吸附于其上的水分子以及因为摩擦力牵引着其他水分子一齐游向负极，此即为电渗效应（带电外壳带着其中溶质运动）。

电渗速度：u op=μop·E；E为电场强度，μop表示电渗的淌度。

电渗的淌度μop：液体在单位时间间隔和单位电场强度下移动的距离。

μop=

εζ2

ζ为管壁的Zeta电势；ε是流体的介电常数；η是介质的粘度。

Zeta电势越大，偶电层越薄，粘度越小，电渗流值越大，在不少情况下电渗流的速度是泳流速度的5—7倍。

粒子在毛细管内的运动是两种速度的矢量和：u= u ep+ u op=(μep+μop)E

μapp=μep+μop；称μapp显示淌度，为粒子电泳淌度和电渗引起的淌度之和。

μapp=μep+μop=u/E=L d·L t t r·V

L d是毛细管进样口到检测器的距离，t r是粒子通过这段距离所用的时间，L t是柱的全长，V是电压。

μapp可直接从毛细管电泳的结果求得；电渗淌度μop可用中性粒子按同样方法测量；带电粒子的电泳淌度可以以中性粒子为参照从上式求得。

【相关知识点】硅胶的等电点：pH=1.5；一般缓冲液浓度：10-50mmol（高浓度：焦耳热多；低浓度：电渗大）。

二、谱带展宽

柱效：N=5.54(t r

W

)2；N为柱效；t r为迁移时间；W为半封宽。

塔板高度：H=L d

N

；H单位塔板高度；L d为进样口到检测器的距离；N为柱效。

【影响谱带展宽的因素】

1.自热：引起温度的径向呈抛物线分布，使粘度在径向形成梯度，从而影响淌度，进而波及到速度。使得靠近管轴中心的分子要比靠近管壁的分子迁移的更快一些，即所谓的速度梯度，造成谱带展宽，使得柱效下降。

温差△T可以由下式计算：

△T=Qr12

2

[

1

k1

ln

r2

r1

+

1

k2

ln

r3

r2

+

1

r3

ln

1

h

]

Q是功密度，r是半径，k是传热系数，h是毛细管壁的传热效率；k1、k2分别代表石英毛细管和聚酰亚胺的传热系数；r1、r2、r3分别代表石英毛细管内径、外径和聚酰亚胺层外径。为使△T变小，管内径以小为宜，外径越大越好，因此，实际采用厚壁的细管子，常用内径50μm，外径达375μm。

抑制焦耳热和温度梯度的方法

方法效果

降低电场强度可相应的减少焦耳热，但同时降低速度、柱效和分离

度

减小毛细管内径显著的减少电流，但将降低灵敏度并可能加剧样品的

吸附

降低缓冲液的离子强度或

浓度

相应的减少电流，但可能引起样品吸附的增加

用物理方法直接降温或恒温

除去毛细管内产生的热量，直接使系统恒温，但要增加仪器的成本

2．扩散：物质由高浓度向低浓度扩散的趋势，是分子微观运动的一种宏观表现。

d m

d t

为单位面积上物质扩散的速率：

d m d t =−D

d c

d x

D为扩散系数，d c

d x

为浓度梯度，负号表示物质扩散方向与浓度梯度方向相反。

D值较小的物质（生物大分子）展宽程度较小，谱带较窄，这种意义上小分子物质分离有不利的一面，但淌度是质荷比的函数，对带相同电荷的小分子来说，具有更大的迁移速度，仍能达到很大的理论塔板数。

3.吸附：确切说是发生在界面的分配作用。引起吸附的原因一般有两个：一、管壁与带相反电荷间的吸引；二、疏水相互作用。

毛细管内表面积与体积之比（2/R）越大，吸附可能性越大，细管径的毛细管不利于降低吸附，但比值增加有利于传热。

三、分离度

分离度R

R=2(t r

2

−t r

1

) W1+W2

下标1、2分别代表相邻的两个物质，t r为迁移时间，W为以时间表示的基线峰宽。

R=1

4

N L2(

△μapp

μ

)

其中：△μapp=△μapp1−△μapp2；μ=△μ

app1

+△μ

app2

2

R=

42 △μapp(

V

op

)

上式显示了电渗对分离的影响：1、如果电渗的方向和粒子迁移的方向相同，那么它的增加将不利于分离，但因为在根号内，所以影响不大；2、电压的增加有利于分离，但为使分离度加倍，电压要增加4倍才行，而这种增加还受到焦耳热的限制，故不是择优的最佳参数；3、μapp和μop大小相同符号相反，或者说粒子和电渗移动方向相反但速度相同，此时的分离度无限大，但是分析时间则会无限延长，故这是不可能的；4、使分离度增加的关键是△μapp，即两组分的淌度差，淌度差的控制与选择借助于选择操作模式和缓冲液体系来实现，而这也是我们的工作内容，选择合适的操作模式和缓冲液体系。

第二部分毛细管电泳的结构

毛细管柱：毛细管电泳的分离过程是在毛细管内完成，因此毛细管是毛细管电泳的核心部件；

检测器：毛细管电泳检测既要做到对溶质的灵敏检测，又要使其微小的区带展宽，所以这里采取的是柱上检测；

数据处理：本实验采用Release Notes for 32 Karat Version 8.0，在windows 7 6位下安装运行，运行时需要一个像U盘似的驱动；

冷却管：对毛细管实行冷却，冷却液在里面运行，有个循环系统；

电极、电源、压力系统等。

【毛细管】