标记免疫技术
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洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊 的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和 流水冲洗式两种。
比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的 液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架 中。用特定的波长测读吸光值。
比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。
通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的 右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法 为"A492nm"或"OD492nm"。
四、均相酶免疫吸测定
基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复 合物后，标记酶的活性发生改变的原理， 在不将复合物与游离酶标抗体分离的情 况下，直接测定系统中总的标记酶活性 的改变，进而推算出待检样品中的抗原 量。
生物素-亲和素 免疫放大技术
……
第一节 酶免疫技术
基本原理
利用酶催化底物反应的生物放大作用, 提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测 敏感性的一种标记免疫技术。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 ②酶促反应专一性，保证特异性。 ③底物反应放大作用，提高敏感性。 ④酶标试剂保存稳定。 ⑤操作简便，安全易行。
低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。
（三）酶标记抗体或抗原
• 基本要求： 酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；
抗体的特异性好，效价高，亲和力强， 比活性高以及易于批量生产和分离纯化。
• 酶标记方法
1.交联法
以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和 抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二 醛交联法。
2.直接法
标记免疫技术
邹全明
第三军医大学医学检验系 临床微生物学和免疫学教研室
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
灵敏性
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
酶免疫技术
荧光免疫技术 放射免疫技术
化学发光技术
金免疫技术
一、 酶免疫技术的分类
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体
均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
异相酶免疫测定
（ELISA）
液相酶免疫测定
பைடு நூலகம்
二、酶免疫技术的技术要点
（一）固相载体
• 基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原
抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大 分子固化后仍保持活性；固化方法简便 易行、快捷经济。
用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗 体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分 子的酶（如HRP）标记物制备。
（四）标记抗体鉴定 （五）免疫吸附剂 （六）试剂最佳工作浓度的选择
三、酶联免疫吸附试验
( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
(一)基本原理：
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保 持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）
适用于分子中具有至少两个抗原决定簇 的多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测
所用两种抗体分别针对同一个抗原分子 的不同抗原决定簇
2．间接法
3.竞争法
特点：
用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体 进行测定。
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗 原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载 体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复 合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上 的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 （酶标抗原抗体复合物的分离）
加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产 物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 （显色反应）
主要用于小分子抗原或半抗原的检测.
(一)酶扩大免疫测定技术:
（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）
• 基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保 留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结 合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性 中心受影响而活性被抑制。
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab） 是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标 记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定 的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非 标记Ag（Ab）的浓度成反比。
4.捕获法（反向间接法）
• 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。
（二）ELISA技术类型：
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗 体，在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物。
酶联试剂
阳性对照
酶标记物
显色液 A
终止液
反应板
显色液 B
浓缩洗涤液 加样枪与吸头
阴性对照
1．双抗体夹心法
特点：
非竞争结合反应 常用于抗原的检测
注意事项：
加样
应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加 在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 保温
1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。 2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴 封纸或保鲜膜覆盖板孔。
洗涤：
决定着实验的成败。 目的：洗去反应液中没有与固相抗原或 抗体结合的物质以及在反应过程中非特 异性吸附于固相载体的干扰物质。
（1）辣根过氧化物酶（HRP）
常用底物：
• 邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应 避光，致癌性。
• 四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色， 无需避光，无致癌性，但水溶性差。
（2） 碱性磷酸酶（AP）
常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP）， 产物为黄色。
* AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率
• 种类与选择
1.塑料制品 2.微颗粒 3.膜载体
（二）酶与酶作用底物
1. 用于标记酶的要求： • 酶活性高 • 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原
与抗体的免疫反应性 • 酶催化底物后信号易判定或测定 • 酶活性不受样品中其他成分的影响 • 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安
全无害，价廉
2. 常用酶及其底物
（二）克隆酶供体免疫测定
比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的 液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架 中。用特定的波长测读吸光值。
比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。
通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的 右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法 为"A492nm"或"OD492nm"。
四、均相酶免疫吸测定
基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复 合物后，标记酶的活性发生改变的原理， 在不将复合物与游离酶标抗体分离的情 况下，直接测定系统中总的标记酶活性 的改变，进而推算出待检样品中的抗原 量。
生物素-亲和素 免疫放大技术
……
第一节 酶免疫技术
基本原理
利用酶催化底物反应的生物放大作用, 提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测 敏感性的一种标记免疫技术。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 ②酶促反应专一性，保证特异性。 ③底物反应放大作用，提高敏感性。 ④酶标试剂保存稳定。 ⑤操作简便，安全易行。
低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。
（三）酶标记抗体或抗原
• 基本要求： 酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；
抗体的特异性好，效价高，亲和力强， 比活性高以及易于批量生产和分离纯化。
• 酶标记方法
1.交联法
以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和 抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二 醛交联法。
2.直接法
标记免疫技术
邹全明
第三军医大学医学检验系 临床微生物学和免疫学教研室
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
灵敏性
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
酶免疫技术
荧光免疫技术 放射免疫技术
化学发光技术
金免疫技术
一、 酶免疫技术的分类
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体
均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
异相酶免疫测定
（ELISA）
液相酶免疫测定
பைடு நூலகம்
二、酶免疫技术的技术要点
（一）固相载体
• 基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原
抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大 分子固化后仍保持活性；固化方法简便 易行、快捷经济。
用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗 体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分 子的酶（如HRP）标记物制备。
（四）标记抗体鉴定 （五）免疫吸附剂 （六）试剂最佳工作浓度的选择
三、酶联免疫吸附试验
( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
(一)基本原理：
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保 持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）
适用于分子中具有至少两个抗原决定簇 的多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测
所用两种抗体分别针对同一个抗原分子 的不同抗原决定簇
2．间接法
3.竞争法
特点：
用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体 进行测定。
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗 原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载 体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复 合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上 的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 （酶标抗原抗体复合物的分离）
加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产 物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 （显色反应）
主要用于小分子抗原或半抗原的检测.
(一)酶扩大免疫测定技术:
（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）
• 基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保 留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结 合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性 中心受影响而活性被抑制。
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab） 是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标 记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定 的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非 标记Ag（Ab）的浓度成反比。
4.捕获法（反向间接法）
• 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。
（二）ELISA技术类型：
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗 体，在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物。
酶联试剂
阳性对照
酶标记物
显色液 A
终止液
反应板
显色液 B
浓缩洗涤液 加样枪与吸头
阴性对照
1．双抗体夹心法
特点：
非竞争结合反应 常用于抗原的检测
注意事项：
加样
应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加 在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 保温
1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。 2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴 封纸或保鲜膜覆盖板孔。
洗涤：
决定着实验的成败。 目的：洗去反应液中没有与固相抗原或 抗体结合的物质以及在反应过程中非特 异性吸附于固相载体的干扰物质。
（1）辣根过氧化物酶（HRP）
常用底物：
• 邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应 避光，致癌性。
• 四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色， 无需避光，无致癌性，但水溶性差。
（2） 碱性磷酸酶（AP）
常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP）， 产物为黄色。
* AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率
• 种类与选择
1.塑料制品 2.微颗粒 3.膜载体
（二）酶与酶作用底物
1. 用于标记酶的要求： • 酶活性高 • 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原
与抗体的免疫反应性 • 酶催化底物后信号易判定或测定 • 酶活性不受样品中其他成分的影响 • 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安
全无害，价廉
2. 常用酶及其底物
（二）克隆酶供体免疫测定