大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估_成玲俐

基金项目:广东省自然科学基金(06021338);广东省科技计划项目
(2007B031508003);佛山科技局(200808109)
*通讯作者,Wushuhua168@
文章编号:1007-4287(2010)08-1163-03
大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估
成玲俐1,吴素华2*,李志梁1,唐
2
,张 瑞1
(1.南海盐步医院,广东佛山528247;2.中山大学附属第一医院;3 南方医科大学珠江医院)
摘要:目的 改进和完善大鼠急性心肌缺血再灌注损伤动物模型的制备及评估。

方法 健康SD 大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。

每组20只。

并从造模成功率、心电图、外周血中LDH 、CK MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方面对改进后的模型进行评估。

结果 改进后的造模成功率达到90%以上,血液动力学、心电图、外周血中LD H 、C K MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方式均证实改良后的动物模型成功。

结论 改进后的方法能大大降低手术难度,提高模型成功率和动物成活率,准确地复制心肌缺血再灌注损伤的实验模型,简化实验操作步骤。

关键词:大鼠;心肌缺血再灌注;动物实验模型中图分类号:R541 4
文献标识码:A
Im proving and Evaluating the Method of Establishing Rat Models of Acute Myocardial Eschem ia Reperfusion C HE NG Ling li ,WU Su hua,LI Zhi lian g ,et a l.(De p a rtment of Ca rdiovascula r ,Yanbu H osp ital o f Nanhai District ,Foshan 528247,China)
Abstract:Objective To i mprove and evaluate the method of establishing rat models of acu te myocardial ischemiareperfusion,which had high rate of success and survive.Methods 60Sprague Dawley rats were divided into three groups at random:con trol group,Sham group and improved myocardial ischemia/reperfusi on group.The successful rate and the effectiveness of each group were observed.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staining,myocardial enzyme spectrum and histology resul ts were used for evaluating the modified model.Results The successful rate of three groups were 90%,100%and 100%,respectively.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staini ng ,myocardial enzyme spectru m and histology all tes tified that the models of modified method were results were successful.Conclusion The method of establish rat models of acu te myocardial ischemia reper fusion is simpleand convenient,with high successful rate and survival rate.
Key words:Rats;Myocardial ischemia reperfusion;E xperimental animal models
(Chin J Lab Diagn,2010,14:1163)
在动物体内阻断左冠状动脉前降支(LAD)造成急性心肌缺血,并在预定时间内恢复血供予以再灌注,是模拟人类缺血性心脏病恢复血供治疗必需的实验方法。

由于大鼠在进化关系上比较接近人类,且其冠状动脉侧支循环少、心肌坏死出现早、心律失常发生率高、稳定性好,且大鼠制作模型费用低廉,从而成为制作心肌缺血再灌注损伤模型的首选,结扎大鼠LAD 形成心肌梗死是目前国内外公认的模型制备方法。

但以往模型制备过程中存在诸多不便,如:手术时反复多次将心脏牵拉到胸腔外,造成动物死亡率增加,加大了实验成本,又加大了动物的创伤;阻断冠状动脉造成缺血后实现再通时,结扎线不易剪断,常导致左心耳破裂,引起心脏撕脱伤,造成大出血;文献报道冠状动脉的定位部位不一,会造成模型缺血损伤部位及损伤程度不一致等。

参照不
同研究人员采用的模型制备方法[1],结合本实验室条件对该模型制作进行了改进,以提高模型制备成功率。

现报告如下。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物与分组 清洁级SD 大鼠,体重220-260g,雄性,合格证号:SC XK(粤)2008-0020。

由广州中医药大学实验动物中心提供。

将大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。

每组20只。

1.1.2 主要仪器和器械 动物呼吸机ALC V8(上海奥尔科特生物科技有限公司),澳大利亚产Power lab16导生理记录仪,无创缝合针(上海医菱医疗器械有限公司);黑色医用缝合线、lOml 一次性无菌注射器、各种手术器械,如止血钳、小无齿弯钳、小镊、小眼科剪等。

1163 中国实验诊断学 2010年8月 第14卷 第8期
1.1.3 主要药品 乙醚、注射用青霉素钠、硫酸庆大霉素注射液、无菌生理盐水注射液。

1.2 实验方法
1.2.1 术前准备及实验大鼠人选标准 大鼠行腹腔注射20%的乌拉坦(0.6ml/100g)麻醉后,仰卧位固定于手术台上,行右颈总动脉导管到颈总动脉和左心室与压力换能器相连,经放大器测量股动脉血压和左心室内压。

标准导程导联与放大器相连,记录心电图,用心电R波计算心率。

连接心电图,肢体导联监测心电,记录标导联心电图各1min,有异常者剔除。

1.2.2 胸部手术 插气管接人工呼吸机,胸部去毛,碘伏消毒。

沿着锁骨中线纵行切开皮肤约2c m,在第三或第四肋间用止血钳逐层游离皮下组织、肌肉,打开胸腔,以扩胸器扩大胸腔,可清晰看到心脏搏动的暗影,剪开心包,在动脉圆锥与左心耳之间,左心耳下缘约3mm处结扎挂线左冠状动脉前降支实行心肌缺血,然后迅速将心脏送回胸腔,医用缝合线的两端留置体外备用。

用长嘴止血钳将胸部皮肤和肌肉以及心脏挂线夹紧,防止气胸发生,观察心电图变化。

T波高耸或者倒置为心肌缺血标志。

如心电图改变不明显,则稍松开止血钳,拉紧一端线头,则明显看到心电图改变。

再灌注时,松开止血钳,放松挂线,形成再灌注模型。

造模结束时,按层次依次缝合肌肉、皮肤,切口处注射少许青霉素注射液,再次碘伏消毒,预防感染。

1.2.3 心肌缺血和再灌注模型制备成功的标志 造模后,心电图表现为ST段抬高和(或)T波高耸或者倒置呈弓背向上单向曲线为心肌缺血标志;再灌注损伤模型成功标志为再灌注后,抬高的ST段下降50%以上或高耸的T波下降(后期可作病理学检查证实)。

1.3 观察指标
1.3.1 模型制备情况 观察各组的造模成功率。

1.3.2 心电图改变 通过观察心电图ST位移值和N ST(计算位移高于0.1mv的数量)的改变可反映心肌缺血程度。

1.3.3 外周血中LDH、CK MB的含量测定 缺血4 h,腹腔静脉取血2ml,离心,取血清,以全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)、CK MB的含量。

1.3.4 心肌病理组织学检查 另取结扎以下0.5 mm处心肌组织小片置4%多聚甲醛保存超过48h。

每个组织块均酒精梯度脱水,石蜡包埋,切片厚约4 m,进行苏木素一伊红(Hae matoxylin Eosin,HE)染色。

光镜下观察心肌组织病理学变化。

1.4 统计学处理
应用SPSS13.0统计软件。

统计每组数据,以x !s表示。

成组资料比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果
2.1 模型制备情况
假手术组(Sham组),缺血组(Ische mia组),缺血再灌注组(I R组)三组,每组20只大鼠,造模成功数分别为19只,20只,18只,成功率分别为95%、100%、90%。

各组间模型鼠造模成功率的比较无统计学差异(P>0.05)。

2.2 对缺血大鼠心电图的影响
IR组ST位移值和N ST均明显小于缺血组(与假手术组比较P<0.05或P<0.01)(表1,2),再灌注后倒置的T波变成正向抬高,有的大鼠可合并出现各种缺血性心律失常的心电图表现。

上述心电图表现符合大鼠心肌缺血及再灌注损伤模型的心电图变化,说明此改进造模方法是成功的。

表1 各处理组大鼠心电图ST段(m V)、ST位移植的影响(n=20,x !s)
检测指标组别缺血前
缺血再灌注(min)
306090120
S T位移值(MV)假手术组0.08!0.060.07!0.060.07!0.090.08!0.080.08!0.08缺血组0.03!0.010.25!0.12**0.29!0.14**0.28!0.14**0.28!0.13**
IR组0.06!0.080.17!0.08*0.20!0.09*0.20!0.08*0.21!0.08** ST位移值(%)假手术组0!00.02!0.010.03!0.020.03!0.020.03!0.02缺血组0!00.22!0.130.27!0.14#0.26!0.14#0.26!0.13#
IR组0!00.14!0.040.14!0.070.15!0.050.15!0.02 与缺血前比较,*为P<0.05,**为P<0.01;IR与假手术组比较,#为P<0.01;与缺血组比较, 为P<0.05, 为P<0.01
2.3 再灌注对缺血大鼠血清酶(LDH,C K MB)水平的影响
再灌注后可降低心肌缺血大鼠血清LDH和C K MB水平,其中指标C K MB变化最为显著,与缺血组比较(1109!245U/L Vs1513!335U/L)差异具有统计学意义(P<0.05)。

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Chin J Lab Diagn,Augus t,2010,Vol14,No.8
2.4 心肌病理组织学检查
假手术组:心肌细胞排列整齐、无变性、间质无水肿、出血。

缺血组:心肌细胞排列紊乱、局部变性、间质水肿、出血明显可见,心肌肌浆呈嗜伊红染色,横纹模糊不清或消失,肌纤维及肌丝明显紊乱,间质有炎性细胞浸润。

IR 组:水肿、变性较缺血组减轻,心肌纤维素紊乱,局部呈波纹状改变,部分肌纤维溶解液化,心肌间质可出现少量红细胞(图1)。

图1 心肌病理组织学检查
3 讨论
急性心肌梗死是心血管疾病中致死率最高的疾病,减少其发生率、降低其死亡率、改善患者生活质
量,是当前医学研究的热点,其中研究最多的是心肌缺血再灌注损伤
[2]。

目前国内外应用最广泛的方法
是结扎大鼠冠状动脉左前降支所致局灶性心肌缺血,通过狭窄或完全闭塞冠状动脉,使其供应区血流减少或缺如,造成心肌缺血。

心肌因缺血、缺氧而发生代谢紊乱以致发生凝固性坏死,其发病过程与机制和临床相似。

传统制备大鼠心肌缺血再灌注模型方法主要有两种
[3]
:使用人工呼吸的心脏原位结扎和胸腔外结
扎。

后者模型的优点是心脏被拉到胸腔外,操作可视性强,但是在进行心肌缺血预处理实验时,需要反复多次将心脏牵拉到胸腔外,常常会造成动物死亡,加大了实验成本。

前者是在由呼吸机维持呼吸的条件下,开胸暴露心脏后,通过推管或压管阻断冠状动脉造成缺血,缺血一定时间后去掉管恢复血液灌注。

这种方式的优点手术操作是在呼吸机的引导下完成,可有充裕的时间进行操作,且心脏处于正常解剖位置,对心脏生理功能影响较小;缺点是由于在胸腔内进行结扎冠状动脉的操作,视野小、心脏不易固定。

我们在前者基础上,利用扩胸器扩大胸腔术野,然后在动脉圆锥与左心耳之间,左心耳下缘处结扎挂线左冠状动脉前降支实行心肌缺血,然后将心脏送回胸腔,缝合线的两端留置体外备用。

用止血钳将胸部皮肤和肌肉以及心脏挂线夹紧,防止气胸发
生,观察心电图变化。

如心电图改变不明显,则稍松开止血钳,拉紧一端线头,则明显看到心电图改变。

再灌注时,松开止血钳,放松挂线,形成再灌注模型。

可如此反复多次再灌注。

除去死亡和不符合模型要求者(结扎后心电图J 点升高不明显),造模成功率达90%以上,较好满足了实验需要。

在I/R 过程中,心电图ST 段的抬高与高尖的T 波融合,甚至病理性Q 波的出现,各种心律失常的出现都能准确地反映大鼠I/R 过程中心电生理的变化,因此,术前和术中对大鼠心电图的监测是客观评价模型制作是否成功的标准之一。

缺血再灌注组(IR 组)ST 位移值和N ST 均明显小于缺血组(与模型组比较P <0.05或P <0.01),心电图表现为T 波倒置呈弓背向上单向曲线,再灌注后倒置的T 波变成正向抬高,有的大鼠可合并出现各种缺血性心律失常的心电图表现。

上述心电图表现符合大鼠心肌缺血及再灌注损伤模型的心电图变化,说明此改进造模方法是成功的。

另外,再灌注后可降低心肌缺血大鼠血清LDH 和CK MB 水平,其中指标CK MB 变化最为显著,与模型组比较(1109!245U/L Vs 1513!335U/L)差异具有统计学意义(P <0.05)。

从病理学上,我们可以观察到假手术组的心肌细胞排列整齐、无变性、间质无水肿、出血。

缺血组的心肌细胞排列紊乱、局部变性、间质水肿、出血明显可见,心肌肌浆呈嗜伊红染色,横纹模糊不清或消失,肌纤维及肌丝明显紊乱,间质有炎性细胞浸润。

与缺血组比较,IR 组的心肌组织间水肿、变性较轻,心肌纤维素紊乱,局部呈波纹状改变,部分肌纤维溶解液化,心肌间质可出现少量红细胞。

综上所述,改进的造模方法能够提高造模的成功率和动物的成活率,降低手术难度,准确地复制心肌I/R 的实验模型,可靠性强、操作简便、重复性好,可以供相关研究参考借鉴。

参考文献:
[1]张新宁,吕 琪,张永亮,等.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改进[J].武警医学院学报,2008,17(11):941.
[2]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibi ti on of myocardial inj ury by ischemic pos t c onditioning duri ng reperfusion:comparison with schemic preconditioning during [J].Am J Physiol Heart Ci rc Physiol,2003,285:H579.
[3]李 晶,邹小华,徐向辉,等.大鼠心肌缺血后处理模型的改良及评价[J].医学临床研究,2008,25(12):2155.
(收稿日期:2009-12-17)
1165 中国实验诊断学 2010年8月 第14卷 第8期。