高效液相色谱仪基础培训课程
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高效液相色谱仪基础 培训课程
液相色谱基础
❖
1. 色谱方法发展 2. 色谱的基本理论 3. 色谱固定相和流动相 4. 色谱系统 5. 定性定量分析方法 6. 简易故障排除
色谱方法的发展过程
Chromatography
色
谱
M.S. Tswett 色谱的创始人—俄国植物学家
组分为何要进行分离
成份分析
收集单一组分或做制备。
色谱基本理论
❖ 色谱的主要理论
热力学理论
❖以相的平衡观点研究色谱过程 ❖塔板理论为代表 (Martin & Synge)
动力学理论
❖以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 ❖Van Deemter 方程为代表
❖ HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： ❖ 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至
在5 min内即可完成。 ❖ 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 ❖ 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器
可达0.1pg。 ❖ 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 ❖ 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以
作用
参与分离作用
分析样品无分子量限制
分析样品分子量一般小于 500 amu
液相色谱的分类
❖ 反相色谱是目前使用最普遍的一种色谱方法
液相色谱分离模式 流动相 固定相
分离机制
吸附法
非极性溶剂 极性填料
吸附
反相色谱
分配法
正相色谱
尺寸排阻离子交换
极性溶剂
非极性溶剂 非交互作用溶
剂 离子对试剂
非极性 极性固相
色谱发展的历史
1959 Porath 和 Flodin 提出尺寸排阻色谱法 1960s Giddings 比较了 LC 和 GC，总结和拓展了前人的理论，
为色谱发展奠定了理论基础。 1960s 将高压泵与化学键和固定相应用于液相色谱，出现了高
压液相色谱系统 1969 Journal of Gas Chromatography 更名為 Journal of
Chromatography 1972 Stein 和 Moore 获诺贝尔化学奖
Majors 和 Kirkland 发明 microparticulate packed columns 1977 Microprocessor controlled pumps 1978 Micron packing 1983 Microbore column
HPLC的特点和优点
❖ 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
❖ 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 ❖ 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达
100种。 ❖ 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品
少。
疏水性交互作用 极性交互作用
聚合凝胶 依尺寸大小选择通过
离子交换剂
电荷相互作用
吸附法
❖ 固定相为固体
1. 硅胶silica 和 alumina（氧化铝） 是最常用的固 定相
❖ 通过一系列的吸附/脱附步骤形成分离
1. 溶质与溶剂均吸附在固定相极性端 2. 样品分子对固定相的吸附程度不同而形成分离
流动相
固定相
分配法
❖ 溶质在液固两相间的相对溶解度不同而达到 分离
与固定相亲和力强的物质其保留时间也较长
❖ 两种基本操作模式
正相分离：极性固定相、非极性流动相 反相分离：非极性固定相、极性流动相
流动相
固定相
分配法
❖ 正相与反相分离
非 极 性 流 动 相
正相色谱
极 性 流 动 相
反相色谱
非极性相互作用
10
毒品, 毒物,酒精 麻醉剂
10
胆汁酸、药物代谢物,尿样提取分析, 雌激 素
10
色谱的基本原理
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固 定相(stationary phase)发生作用（吸附、分 配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱 不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后 从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
液相色谱仪器概述
液相色谱仪器组成
❖ 溶剂传输系统
进样系统
（泵系统）
工作站
组分收集（选相）
检测器
液相色谱仪器结构
组成示意图
流动相储液瓶
柱后反应器
检测器
馏分收集器
单元或多元泵
梯度混合器
预柱
手动-进样器 自动-进样器
色谱柱
保护柱 柱温箱
积分仪 温度控制单元
工作站 计算机
样品制备单元
接口
液相色谱的应用
NH2
硅胶基体
键和官能团 (C8)
SO3-
范德华力 Van der Waals forces
极性相互作用
硅胶基体
O OH
H O
C N
H O
O H
Dipolar attraction or hydrogen bonding
色谱发展的历史
1903 俄国植物学家 Tswett 以 CaCO3 为吸附剂、经石油醚洗 脱分离植物色素
应用领域 药物分析 生物化学
食品、饮料 化学工业 环境分析 滥用药物
临床实验
样
品
抗生素, 镇静剂, 类固醇, 止痛?
市场比例 30
氨基酸, 蛋白, 糖类, 脂质类
10
人工合成甜味剂, 抗氧化剂, 黄曲霉素, 添 加剂
10
浓缩香料, 表面活性剂, 染料,
20
杀虫剂, 除草剂， 苯酚, PCBs, PAHs
定量
样品纯化
分离
定性
联用技术
色谱方法分类
❖ 不同的流动相和固定相构成不同分离方式
气液 相相 色色 谱谱
HPLC 与 GC 的应用差异
HPLC
GC
在室温下分析
通常在高温下分析，要求样 品必须具有热稳定性
样品必须溶于流动相，但不 必须是挥发性的
样品必须是挥发性的
固定相与流动相均参与分配 流动相只用来带动样品，不
1931 Kuhn 和 Lederer 重复 Tswett 实验分离胡萝卜素 1938 Kuhn 和 Lederer 获诺贝尔化学奖 1940 Martin 和 Synge 提出液液分配色谱与塔板理论 1944 Consden 发展出纸色谱 1949 Macllean 等人在氧化铝中加入淀粉黏合剂制成 TLC 1952 Martin 和 Synge 获诺贝尔化学奖 1952 Martin 和 James 发表完整的气相色谱方法 1956 VanDeemter 提出色谱速率理论 1957 Golay 开创毛细管柱气相色谱方法 1958 Stein 和 Moore 开发自动氨基酸分析
液相色谱基础
❖
1. 色谱方法发展 2. 色谱的基本理论 3. 色谱固定相和流动相 4. 色谱系统 5. 定性定量分析方法 6. 简易故障排除
色谱方法的发展过程
Chromatography
色
谱
M.S. Tswett 色谱的创始人—俄国植物学家
组分为何要进行分离
成份分析
收集单一组分或做制备。
色谱基本理论
❖ 色谱的主要理论
热力学理论
❖以相的平衡观点研究色谱过程 ❖塔板理论为代表 (Martin & Synge)
动力学理论
❖以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 ❖Van Deemter 方程为代表
❖ HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： ❖ 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至
在5 min内即可完成。 ❖ 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 ❖ 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器
可达0.1pg。 ❖ 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 ❖ 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以
作用
参与分离作用
分析样品无分子量限制
分析样品分子量一般小于 500 amu
液相色谱的分类
❖ 反相色谱是目前使用最普遍的一种色谱方法
液相色谱分离模式 流动相 固定相
分离机制
吸附法
非极性溶剂 极性填料
吸附
反相色谱
分配法
正相色谱
尺寸排阻离子交换
极性溶剂
非极性溶剂 非交互作用溶
剂 离子对试剂
非极性 极性固相
色谱发展的历史
1959 Porath 和 Flodin 提出尺寸排阻色谱法 1960s Giddings 比较了 LC 和 GC，总结和拓展了前人的理论，
为色谱发展奠定了理论基础。 1960s 将高压泵与化学键和固定相应用于液相色谱，出现了高
压液相色谱系统 1969 Journal of Gas Chromatography 更名為 Journal of
Chromatography 1972 Stein 和 Moore 获诺贝尔化学奖
Majors 和 Kirkland 发明 microparticulate packed columns 1977 Microprocessor controlled pumps 1978 Micron packing 1983 Microbore column
HPLC的特点和优点
❖ 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
❖ 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 ❖ 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达
100种。 ❖ 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品
少。
疏水性交互作用 极性交互作用
聚合凝胶 依尺寸大小选择通过
离子交换剂
电荷相互作用
吸附法
❖ 固定相为固体
1. 硅胶silica 和 alumina（氧化铝） 是最常用的固 定相
❖ 通过一系列的吸附/脱附步骤形成分离
1. 溶质与溶剂均吸附在固定相极性端 2. 样品分子对固定相的吸附程度不同而形成分离
流动相
固定相
分配法
❖ 溶质在液固两相间的相对溶解度不同而达到 分离
与固定相亲和力强的物质其保留时间也较长
❖ 两种基本操作模式
正相分离：极性固定相、非极性流动相 反相分离：非极性固定相、极性流动相
流动相
固定相
分配法
❖ 正相与反相分离
非 极 性 流 动 相
正相色谱
极 性 流 动 相
反相色谱
非极性相互作用
10
毒品, 毒物,酒精 麻醉剂
10
胆汁酸、药物代谢物,尿样提取分析, 雌激 素
10
色谱的基本原理
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固 定相(stationary phase)发生作用（吸附、分 配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱 不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后 从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
液相色谱仪器概述
液相色谱仪器组成
❖ 溶剂传输系统
进样系统
（泵系统）
工作站
组分收集（选相）
检测器
液相色谱仪器结构
组成示意图
流动相储液瓶
柱后反应器
检测器
馏分收集器
单元或多元泵
梯度混合器
预柱
手动-进样器 自动-进样器
色谱柱
保护柱 柱温箱
积分仪 温度控制单元
工作站 计算机
样品制备单元
接口
液相色谱的应用
NH2
硅胶基体
键和官能团 (C8)
SO3-
范德华力 Van der Waals forces
极性相互作用
硅胶基体
O OH
H O
C N
H O
O H
Dipolar attraction or hydrogen bonding
色谱发展的历史
1903 俄国植物学家 Tswett 以 CaCO3 为吸附剂、经石油醚洗 脱分离植物色素
应用领域 药物分析 生物化学
食品、饮料 化学工业 环境分析 滥用药物
临床实验
样
品
抗生素, 镇静剂, 类固醇, 止痛?
市场比例 30
氨基酸, 蛋白, 糖类, 脂质类
10
人工合成甜味剂, 抗氧化剂, 黄曲霉素, 添 加剂
10
浓缩香料, 表面活性剂, 染料,
20
杀虫剂, 除草剂， 苯酚, PCBs, PAHs
定量
样品纯化
分离
定性
联用技术
色谱方法分类
❖ 不同的流动相和固定相构成不同分离方式
气液 相相 色色 谱谱
HPLC 与 GC 的应用差异
HPLC
GC
在室温下分析
通常在高温下分析，要求样 品必须具有热稳定性
样品必须溶于流动相，但不 必须是挥发性的
样品必须是挥发性的
固定相与流动相均参与分配 流动相只用来带动样品，不
1931 Kuhn 和 Lederer 重复 Tswett 实验分离胡萝卜素 1938 Kuhn 和 Lederer 获诺贝尔化学奖 1940 Martin 和 Synge 提出液液分配色谱与塔板理论 1944 Consden 发展出纸色谱 1949 Macllean 等人在氧化铝中加入淀粉黏合剂制成 TLC 1952 Martin 和 Synge 获诺贝尔化学奖 1952 Martin 和 James 发表完整的气相色谱方法 1956 VanDeemter 提出色谱速率理论 1957 Golay 开创毛细管柱气相色谱方法 1958 Stein 和 Moore 开发自动氨基酸分析