第7章基因治疗精品PPT课件
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皮肤成纤维细胞、肝细胞等，随机整合
9
7.1.1 基因治疗的途径与策略
基因治疗途径： • 体外基因治疗（ex vivo）：是将含外源基因的表达
载体导入人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后 输入人体。 • 体内基因治疗（in vivo）：是将含外源基因的真核 细胞表达载体直接导入人体内。 已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病 扩大到获得性疾病。
➢ ②基因分离：指利用DNA重组技术克隆、鉴定、 扩增和纯化用于治疗的基因，并根据病变基因 的定位，与特异性整合序列和基因表达调控元 件进行体外重组。
13
➢ ③载体构建： • 病毒型载体：腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、
反转录病毒载体等，它是基因治疗中使用的主要 载体； • 非病毒型载体：脂质体载体和多聚阳离子载体等。
15
16
基因治疗－－理论和技术上的挑战
1.缺乏更多更好的治疗基因： 2.缺乏高效特异的基因导入系统：转移效率、特
异性 靶向载体 3.治疗基Hale Waihona Puke Baidu表达缺乏可调控性：包括空间上的可
调控性和时间上的可调控性。 4.表达水平低 5.随机整合带来的问题
17
基因治疗－－社会伦理学上的挑战
➢治疗的安全性问题 ➢基因治疗模式与现有伦理道德的冲突。
广义：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使 其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。
基因工程操作都在体外完成，基因治疗需将基因导 入人体细胞，所以在有效性和安全性方面要求更高。
5
鸟氨酸转氨甲酰酶
6
基因治疗的发展
• 美国，世界上开展基因治疗最早的国家。1990 年9月14日，第一例正式批准的基因治疗实验 开始进行，4岁ADA缺陷病人
10
基因治疗的两种途径
ex vivo
靶细胞
载体 目的基因
in vivo
11
基因治疗的总体策略
1、基因矫正（修正）（gene correction）：未实现 2、基因置换 （gene replacement）： 3、基因修饰（增补）（gene augmentation）： 4 、基因激活（gene activation）： 5 、基因失活（干预）（gene interference ）：反
义核酸、核酶、RNAi 6 、药物敏感疗法：“自杀基因”的应用：旁观
者效应 7 、免疫基因治疗 8、耐药基因治疗
自杀基因的作用机制 12
7.1.2 基因治疗基本程序
➢ ①基因诊断：利用多种基因检测技术如限制性 片段长度多态性分析（RFLP）、PCR扩增靶序 列法和人类基因库搜寻法等对人体病变基因进 行定位。
➢ ④基因转移： • 体内疗法：病毒颗粒直接注射法、重组DNA分子
直接注射法、呼吸道吸入法、基因枪转移法和电 穿孔法等。 • 体外疗法：病毒转染法。
14
7.1.3 基因治疗的现状与问题
• 恶性肿瘤 64.6%，心血管8.9%，艾滋病7.9% • 美国63.4%，欧洲27%，日本与澳大利亚1.1%
和1.8%
18
7.2 基因治疗的载体
7.2.1 逆转录病毒载体 7.2.2 腺病毒载体 7.2.4 单纯疱疹病毒
19
7.2.1 逆转录病毒载体
• 正链RNA病毒
• 5’ gag- pol-
env 3’
(编码核心蛋白)(逆转录酶)(编码病毒包膜蛋白)
• 病毒感染细胞后，逆转录成双链DNA，整合在染 色体上，以此合成病毒基因及RNA，装配成病毒 颗粒。
第七章 基因治疗
• 7.1 基因治疗的概念和策略 • 7.2 基因治疗的载体 • 7.3 重要疾病的基因治疗
1
7.1 基因治疗的概念和策略
基因诊断（ Gene diagnosis ）
以DNA和RNA为诊断材料，利用现代分子生物 学和分子遗传学的技术方法，检测基因结构及其 表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。
• 2009年，佛罗里达大学三位患有Leber先天性 黑矇(LCA)2型的遗传性盲患者
• 中国：1991年7月开始进行基因治疗临床实验， 血友病B，Ⅸ因子治疗后浓度上升，出血症状 减轻,取得了安全有效的治疗效果。
7
8
基因治疗： • 生殖细胞(germ cell)基因治疗 • 体细胞(somatic cell)基因治疗：骨髓细胞、
③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体 外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基 表达水平达正常人的5%。
我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗，
是我国基因治疗成功的例子。
23
24
7.2.2 腺病毒载体
• 腺病毒（Adenovirus，Adv）：一类20面体 病毒
20
➢ 逆转录病毒载体优点： 1、基因组小而简单，可随机整合 2、感染效率高 3、侵染范围广 4、原病毒稳定拷贝数低 5、对宿主细胞无毒副作用 6、10 kbDNA
➢ 缺点： 1、仅转染分裂期细胞；2、随机插入的风险
21
基因治疗基本过程 例1
ADA-Gene + vector （逆转录病毒）
重组分子 患者T Ly C 导入
细胞生长分裂
10天 Gene表达
IL-2刺激C分裂
回输患儿体内
1~2月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%
22
基因治疗基本过程 例2
• 逆转录病毒载体 +FⅨcDNA
重组体
5` LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3`
①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达；
②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养） →FⅨ表达；
• PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段 142 bp
99 bp • Bcl I 限制酶：酶切位点在
基因内18号外显子3´端
父母
儿 胎儿
• 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
( 先证者) (女)
感染性疾病的基因诊断 4
基因治疗
基因治疗（gene therapy） ：指以正常的基 因替代或修补病人细胞中的缺陷基因从而达到 治疗疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的 手段之一。（狭义）
1、内源基因的变异 2、外来生物的入侵
基因致病
基因结构的异常 基因表达的异常
2
基因诊断常用技术
• 核酸分子杂交： • PCR： • 生物芯片： DNA芯片或基因芯片 • 基因测序：
3
血友病A基因诊断
• 病因：factor VIII 基因缺陷 （碱基取代、缺失或插入等）， 使凝血因子VIII 无活性或不 稳定，导致凝血障碍。
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7.1.1 基因治疗的途径与策略
基因治疗途径： • 体外基因治疗（ex vivo）：是将含外源基因的表达
载体导入人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后 输入人体。 • 体内基因治疗（in vivo）：是将含外源基因的真核 细胞表达载体直接导入人体内。 已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病 扩大到获得性疾病。
➢ ②基因分离：指利用DNA重组技术克隆、鉴定、 扩增和纯化用于治疗的基因，并根据病变基因 的定位，与特异性整合序列和基因表达调控元 件进行体外重组。
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➢ ③载体构建： • 病毒型载体：腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、
反转录病毒载体等，它是基因治疗中使用的主要 载体； • 非病毒型载体：脂质体载体和多聚阳离子载体等。
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基因治疗－－理论和技术上的挑战
1.缺乏更多更好的治疗基因： 2.缺乏高效特异的基因导入系统：转移效率、特
异性 靶向载体 3.治疗基Hale Waihona Puke Baidu表达缺乏可调控性：包括空间上的可
调控性和时间上的可调控性。 4.表达水平低 5.随机整合带来的问题
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基因治疗－－社会伦理学上的挑战
➢治疗的安全性问题 ➢基因治疗模式与现有伦理道德的冲突。
广义：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使 其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。
基因工程操作都在体外完成，基因治疗需将基因导 入人体细胞，所以在有效性和安全性方面要求更高。
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鸟氨酸转氨甲酰酶
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基因治疗的发展
• 美国，世界上开展基因治疗最早的国家。1990 年9月14日，第一例正式批准的基因治疗实验 开始进行，4岁ADA缺陷病人
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基因治疗的两种途径
ex vivo
靶细胞
载体 目的基因
in vivo
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基因治疗的总体策略
1、基因矫正（修正）（gene correction）：未实现 2、基因置换 （gene replacement）： 3、基因修饰（增补）（gene augmentation）： 4 、基因激活（gene activation）： 5 、基因失活（干预）（gene interference ）：反
义核酸、核酶、RNAi 6 、药物敏感疗法：“自杀基因”的应用：旁观
者效应 7 、免疫基因治疗 8、耐药基因治疗
自杀基因的作用机制 12
7.1.2 基因治疗基本程序
➢ ①基因诊断：利用多种基因检测技术如限制性 片段长度多态性分析（RFLP）、PCR扩增靶序 列法和人类基因库搜寻法等对人体病变基因进 行定位。
➢ ④基因转移： • 体内疗法：病毒颗粒直接注射法、重组DNA分子
直接注射法、呼吸道吸入法、基因枪转移法和电 穿孔法等。 • 体外疗法：病毒转染法。
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7.1.3 基因治疗的现状与问题
• 恶性肿瘤 64.6%，心血管8.9%，艾滋病7.9% • 美国63.4%，欧洲27%，日本与澳大利亚1.1%
和1.8%
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7.2 基因治疗的载体
7.2.1 逆转录病毒载体 7.2.2 腺病毒载体 7.2.4 单纯疱疹病毒
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7.2.1 逆转录病毒载体
• 正链RNA病毒
• 5’ gag- pol-
env 3’
(编码核心蛋白)(逆转录酶)(编码病毒包膜蛋白)
• 病毒感染细胞后，逆转录成双链DNA，整合在染 色体上，以此合成病毒基因及RNA，装配成病毒 颗粒。
第七章 基因治疗
• 7.1 基因治疗的概念和策略 • 7.2 基因治疗的载体 • 7.3 重要疾病的基因治疗
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7.1 基因治疗的概念和策略
基因诊断（ Gene diagnosis ）
以DNA和RNA为诊断材料，利用现代分子生物 学和分子遗传学的技术方法，检测基因结构及其 表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。
• 2009年，佛罗里达大学三位患有Leber先天性 黑矇(LCA)2型的遗传性盲患者
• 中国：1991年7月开始进行基因治疗临床实验， 血友病B，Ⅸ因子治疗后浓度上升，出血症状 减轻,取得了安全有效的治疗效果。
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基因治疗： • 生殖细胞(germ cell)基因治疗 • 体细胞(somatic cell)基因治疗：骨髓细胞、
③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体 外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基 表达水平达正常人的5%。
我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗，
是我国基因治疗成功的例子。
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7.2.2 腺病毒载体
• 腺病毒（Adenovirus，Adv）：一类20面体 病毒
20
➢ 逆转录病毒载体优点： 1、基因组小而简单，可随机整合 2、感染效率高 3、侵染范围广 4、原病毒稳定拷贝数低 5、对宿主细胞无毒副作用 6、10 kbDNA
➢ 缺点： 1、仅转染分裂期细胞；2、随机插入的风险
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基因治疗基本过程 例1
ADA-Gene + vector （逆转录病毒）
重组分子 患者T Ly C 导入
细胞生长分裂
10天 Gene表达
IL-2刺激C分裂
回输患儿体内
1~2月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%
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基因治疗基本过程 例2
• 逆转录病毒载体 +FⅨcDNA
重组体
5` LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3`
①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达；
②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养） →FⅨ表达；
• PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段 142 bp
99 bp • Bcl I 限制酶：酶切位点在
基因内18号外显子3´端
父母
儿 胎儿
• 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
( 先证者) (女)
感染性疾病的基因诊断 4
基因治疗
基因治疗（gene therapy） ：指以正常的基 因替代或修补病人细胞中的缺陷基因从而达到 治疗疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的 手段之一。（狭义）
1、内源基因的变异 2、外来生物的入侵
基因致病
基因结构的异常 基因表达的异常
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基因诊断常用技术
• 核酸分子杂交： • PCR： • 生物芯片： DNA芯片或基因芯片 • 基因测序：
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血友病A基因诊断
• 病因：factor VIII 基因缺陷 （碱基取代、缺失或插入等）， 使凝血因子VIII 无活性或不 稳定，导致凝血障碍。