结核病实验室检查的临床意义

结核分枝杆菌群
• 结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原 体，包括人结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、 非洲分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝 杆菌（M.microti），前三种对人类治病， 其中人型结核分枝杆菌感染发病率最高。
结核菌培养临床价值
确诊结核病
1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份 痰标本结核分枝杆菌培养阳性即可确诊。 痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性 肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆 菌培养阳性
用于耐多药结核疗效判定
治愈： （1）患者完成疗程，且在疗程的后12个月，至少最 后5次痰培养（每次间隔至少30天）连续阴性。 （2）如出现1次痰培养阳性，其后痰培养（间隔至 少30天）最少连续3次阴性。 失败： 治疗的最后12个月，5次痰培养中有两次或两次以 上阳性；或者在最后的3次，培养中有任何一次是 阳性。
• 灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很 高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
实验结果的解释
• 阴性结果 提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。 假阴性结果： ①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全患者 • 阳性结果 提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结 核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测 指标综合判断。 假阳性结果： ① 4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai （苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）
血清学检测的评价
WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比， 这些试剂盒检测的灵敏度为1%~60%，特异度为53~99% 1 。
2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检 测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性， 因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1 。
• 结核抗体测定 • 结核抗原测定 • 循环免疫复合物测定
血清学诊断
血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。
无需活细胞培养和特殊仪器设备
操作简便 结果显示快速
目前用于血清学诊断的主要方法:
酶联免疫吸附试验(ELlSA) 斑点金免疫渗滤法(DIGFA) 免疫印迹法(Western Blotting)等等
结核杆菌PCR检测的临床意义
• 1.在痰菌阴性结核快速诊断有重要临床应用 价值。
• 在临床工作中，痰菌阴性，经临床综合分析后诊 断为肺结核的患者，约占肺结核患者的60%-70%。 有报道指出痰菌阴性的肺结核患者，如果未经抗 结核治疗，经过1-3年的随访，将有40%-60%的患 者发展为菌阳甚至更典型的肺结核。所以获得病 原学的诊断至关重要
方法学的优点
• 检测特异性的提高
– 帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的 “假阳性”，避免了临床的无效用药
• 检测灵敏度的提高
– 有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的 传播与扩散
• 快速 – 48小时出结果
方法学的局限
• 不能区分活动性TB与潜伏感染
• 不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临
床的判断 • 目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者 是活动性结核病或是潜伏感染者 • 不适合用于结核病患者治疗的疗效监测 • 检测收费高（600-700元/次）
体外r-干扰素释放试验
IGRA在评价抗结核治疗中的作用是有限的 活动性结核病通过有效的抗结核治疗后，结 核杆菌载量下降，效应T细胞数量会随之减少，所 以理论上IGRA结果应从阳性转变为阴性，但临床 实践中发现IGRA结果转阴率非常低。2012年发表 的一篇meta分析中指出，T-SPOT.TB在结核病患者 抗结核治疗后转阴率为5.71%-13.93%，说明IGRA 在评价抗结核治疗方面作用是有限的。
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基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意 大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核 诊疗指南中。
目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：
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1）澳大利亚Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube （QFT-GIT） 2）英国Oxford Immunotec公司的T-SPOT.TB
蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验（IGRA)
• 结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次 受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检 测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。 由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为 机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。
百度文库
缺点：
不能区别结核分枝杆菌和非结核分支杆菌 不能区别死菌跟活菌。 结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失 去抗酸性，出现假阴性。 检测灵敏度较低（104-105 个细菌/毫升）。
分枝杆菌分离培养
结核菌培养仍是目前诊断结核病的金标准．尤其是药敏试验结果 在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用, 是鉴定是否 为活菌的可靠方法． 传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳性率也只有30％-40 ％；特异性差．各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核 菌．需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。 快速培养法: 检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2，显微镜直接观 察、变色液体培养基等。 快速培养法阳性的报告时间大概是1—3周左右，比传统的固态培 养法快，但是仪器价格太昂贵。
分离培养的优点
敏感性较直接涂片法高，理论上10-100条菌/ 毫升可检出阳性； 特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速 度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌； 分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏 试验提供基础。
分离培养的缺点
需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。
结核分枝杆菌实验 室检测方法
主要内容
一、结核杆菌的病原学基础 二、结合分支杆菌全球的流行情况 三、结核杆菌的实验室检测方法及临床应用
一、结核病的病原学基础
• 结核杆菌属： 一类细长略带弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属细 菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有 大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致 病性等密切相关。 本属细菌已经被鉴定的有70多种，可分为三大类： 结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌； 按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长 菌和不能培养菌三种类型

结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响， 操作较直接涂片法复杂，需经严格培训 ，对实验室要求也是较高。
成本是直接涂片法的7-8倍。
涂片染色镜检
细菌学检查
分枝杆菌分离培养
分支杆菌药敏试验
分枝杆菌菌种鉴定
结核病
体液免疫学检查 免疫学检查
实验室检查
细胞免疫学检查
分子生物学检查
体液免疫学检查（血清学检查）
结核病细胞免疫学检查
• 结核菌素皮肤实验 • 蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验 （IGRA)
结核菌素实验（PPD试验）
迟发型细胞超敏反应 1）方法：1:2000 OT或PPD液0.1毫升(5单位 )，左前臂屈侧中部皮内注射，48～72h测量 皮肤硬结的直径。
2）判断标准：
阴性≤4mm 弱阳性5-9mm 阳性10-19mm， 强阳性≥20mm 或局部出现水泡 与坏死
涂片染色镜检临床价值
适用于多种标本； 操作简便，价格低廉。
涂片镜检的临床应用
一、确诊涂阳结核病及开放性结核
2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性； 1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+影像 学检查符合活动性肺结核表现。
涂片镜检的临床应用
二、肺结核治疗评估的主要依据之一
治愈：涂阳肺结核患者完成规定疗程，连续2次涂 片结果阴性，其中1次是治疗末的涂片。 治疗失败：新涂阳患者治疗第5个月末或疗程结束 时，痰涂片检查阳性，涂阴肺结核患者治疗过程 中任何1次痰菌检查阳性，均为治疗失败。
T-SPOT®.TB原理
T-SPOT®.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），
通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存 在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核 杆菌（现症感染）的新方法。 结核杆菌特异抗原： •早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6， ESAT-6）
涂片染色镜检
细菌学检查
分枝杆菌分离培养
分支杆菌药敏试验
分枝杆菌菌种鉴定
结核病
体液免疫学诊断 免疫学检查 细胞免疫学诊断
实验室检查
分子生物学检查
聚合酶链反应（PCR） DNA测序 DNA探针技术 基因芯片技术
分子生物学检测方法
• 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发 展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验 提供了极大的方便，可将诊断时间从几周 降低到几天甚至是几个小时。研究、应用 报道较多的结核病基因诊断技术主要包括 聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA 序列测定、基因芯片、基因分型等。
1
WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis.
http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf 原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差 异较大，并且缺乏可比性。
3)结核菌素试验的意义 阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。 阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。 强阳性：活动性结核病可能
A、变态反应尚未建立； B、免疫抑制如应用皮质 激素或营养不良等
PPD试验临床价值
PPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗 菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的 影响，特异性较差。 当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果，敏感性低。 免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结 核变态反应、淋巴结核强阳性多。 经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但 存在着明显的缺陷。
•培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）
T-SPOT®.TB临床性能指标
• 特异性 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆 菌和卡介苗（BCG）无交叉反应
美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
• 结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌
• 及时准确的诊断结核病，有效地控制传染
源，对预防结核病至关重要。
涂片染色镜检
细菌学检查
分枝杆菌分离培养
分支杆菌药敏试验
分枝杆菌菌种鉴定
结核病
实验室检查
免疫学检查
分子生物学检查
涂片染色镜检
最原始最基础的检测方法
抗酸染色的原理
• 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质。包 围在肽聚糖的外面，所以分支杆菌一般不 易着色，需要经过加热或是延长染色时间 来促使其着色。但分支杆菌中的分支菌酸 与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色， 故名抗酸染色。
Chiappini E, Fossi F, Bonsignori F, et al. Utility of interferon-γ release assay results to monitor anti-tubercular treatment in adults and children. Clin Ther, 2012, 34: 1041-1048.
实时荧光PCR技术
• 本实验室所使用的结核分枝杆菌核酸检测 试剂盒（荧光PCR法）采用单管单人份的分 装技术，操作过程非常简便；并引入荧光 检测技术，简化了检测步骤，并且整个扩 增及扩增后检测都无需打开扩增管盖，从 根本上克服了PCR遗留污染。荧光探针PCR 检测技术综合了PCR扩增的高敏感性、探针 杂交的高特异性及荧光能量转移的实时跟 踪特性，使检测的准确性大大提高，并可 充分保证检测的稳定性及重复性。