8外源基因的表达系统

基因表达
遗传信息从DNA 到蛋白质的传递 过程——中心法 则（central dogma）。
克隆基因的表达
外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
第一节 基因表达的机制
1 外源基因的起始转录 2 mRNA的延伸与稳定性 3 外源基因mRNA的有效翻译 4 表达蛋白在细胞中的稳定性 5 目的基因沉默
原核生物基因表达的启动子可分为: 诱导型启 动子和组成型启动子(前者如lac trp等的启动 子,后者如T7噬菌体的启动子)。 真核生物基因表达的启动子可分为：诱导型、 组织特异型和组成型等类型。
2 mRNA 的延伸与稳定性
转录后 , 保持 mRNA 的有效延伸、终止及稳定是基 因有效表达的关键。在转录物内的衰减和非特异性 终止都可诱发转录中的mRNA提前终止。 衰减子 (attenuator) 类似于简单的终止子 , 在原 核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基 因之间。在构建表达载体时要尽量避免该序列的存 在。为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止可 以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。
5.3 转录后水平的基因沉默
是在RNA水平上的基因调控，比转录水平的基 因沉默 更普遍。共抑制(cosuppression)是转录后水平基因 沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其 同源的内源DNA的表达也受到抑制。转录后水平的基 因沉默的特点是外源基因能够转录成mRNA，但正常的 mRNA不能积累，mRNA合成后就被降解或被相应的反义 RNA或蛋白质封闭，因而不能指导mRNA的翻译。
在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的 不同质粒载体不能共存，但含不同类型复制子 的不同质粒载体则可以共存于同一细胞中 。
（2）启动子
启动子与 mRNA 的合成有很大关系。 在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动 子与转录起始位点之间的距离为6～ 9bp,但启动子与转录起始位点的最佳 距离还有待实验来确定。
mRNA 的稳定性直接决定翻译产物的多少。 对原核细胞来说 , 最佳的 方法是选择一 个 RNase 缺失的受体菌。对真核细胞来 说 , 则需要考虑增加 mRNA 的正确加工 , 提高成熟 mRNA 的稳定性。
3 外源基因 mRNA 的有效翻译
在原核细胞中影响翻译起始的因素有:起始密 码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与 SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结 构、mRNA上游的5'端非翻译序列和蛋白编码区 的5'端序列等。因此,外源基因mRNA有效翻译 须考虑下列基本原则:
⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无 特定的空间构象。
⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产 物的不稳定性。
2.2大肠杆菌表达系统
2.2.1正确表达的基本条件
基因在大肠杆菌细胞中实现正确有效表达的 基本条件是必须能够正常地转录和翻译，在 许多情况下还需进行转录后加工以及在细胞 中正确定位，这些过程中的任何一步发生差 错，都会导致该基因表达的失败。所以必须 考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞 的启动子和SD序列、开放读码框架(open reading frame，ORF)及宿主菌调控系统等基 本条件，
5.2 转录水平的基因沉默
是在DNA水平上的基因调控，主要是由于启动子的甲 基化或外源基因的异染色质化而引起的。重复序列 可导致自身甲基化，外源基因若以多拷贝的形式整 合到同一位点上，形成首尾相接的正向重复(direct repeat)或头对头、尾对尾的反向重复(invert repeat)序列，则外源基因不能表达，并且拷贝数越 多，基因沉默现象越严重。其原因可能是由于重复 序列自发配对，甲基化酶特异性地识别这种配对结 构而使其甲基化，从而抑制其表达。
◆大肠杆菌缺乏复杂翻译后加工和蛋白质折叠系统。
◆大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达 产物的稳定因子。
◆大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度 微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。
为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因 表达受体菌的大肠杆菌工程菌株。
4 表达蛋白在细胞中的稳定性
外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定 积累而不被内源蛋白水解酶 所水解是基因 有效表达的一个重要因素。如果表达的外源 蛋白具有 相同或类似于宿主细胞天然蛋白 的构象 , 则被降解的可能性就会大大降低。
避免外源基因表达蛋白降解
①构建融合蛋白表达系统：在融合蛋白中外源蛋白与受体细 胞蛋白能形成良好的杂合构象，它能在较大程度上封闭外源 蛋白分子上的水解酶作用位点，从而增加其稳定性。 ②构建分泌蛋白表达系统：使外源基因表达的蛋白质分泌到 细胞周质腔或直接分泌到培养基中，避免细胞内的水解酶对 表达蛋白的降解。 ③构建包涵体表达系统：外源基因的表达产物以包涵体的形 式存在于受体细胞中不易被宿主蛋白水解酶所降解。 ④选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。
第二节 外源基因表达系统
1 概述 2 原核基因表达系统 3 真核基因表达系统
1 概述
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受 体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物 基因表达系统和真核生物基因表达系统。目前 应用最广泛的是原核生物基因表达系统，如大 肠杆菌表达系统、芽子包杆菌表达系统、链霉 菌 表达系统和蓝藻表达系统等。
转录↓
5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)
RNA折叠↓
mRNA折叠
C
UC
UG G—C
脱落
A—U
C—G
C—G
G—C
C—G
C—G G—C
RNA聚合酶
AA
CCCAC
UUUU—3
DNA
2.2.3 宿主菌
◆ 大肠杆菌基因表达系统的基因一般都是异源基因， 某些甚至是真核生物基因，而在细胞内积累大量的 异源蛋白极易被降解。造成重组异源蛋白在大肠杆 菌中不稳定的原因包括：
启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。
启动子序列
大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致 顺序（consensus sequence）。
-35 Box 和 -10 Box
consensus sequences
① -35box RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’
2 原核基因表达系统
2.1原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下 特点:
①原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易 于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
②基因组结构简单，便于基因操作和分析。
③多数原核生物细胞内含有质粒或噬茵体，便于构 建相应的表达载体。
④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。
1 外源基因的起始转录
外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核 心问题，而外源基因的起始转录又是基因表达的关 键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。 选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一 个表达系统首先要考虑的问题。
一般来说，理想的可调控的启动子在细胞生长的初 期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密 度后，在某种特定的诱导因子(如温 度、光和化学 药物等)的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录,合成 mRNA。
正确表达的基本条件
①外源基因不能带有间隔序列(内含子)； ②必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元 件控制外源基因的表达； ③外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开 放阅读框架； ④通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿 主菌的酶系统合成外源蛋白； ⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子 intrinsic terminator：
E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段 反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内 终止子，形成终止信号。
原因：
① 茎环结构
反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎 环结构，使转录物与模板之间配对的碱基 数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作
2.2.2大肠杆菌基因表达载体
大肠杆菌基因表达载体的构建，应包括这 些基因元件：复制子、启动子、核糖体结合 位点、终止子、密码子、选择标记等。
（1）复制子
复制子：复制子是一段包含复制子起始位点和 反式因子作用区在内的DNA片段。大肠杆菌基 因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体， 含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序 列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。
② 多聚A/U
由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性 比较差，有利于转录物脱落而不利于转录 延续。
5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)
AUG的距离也影响翻
2）起始密码：
位于SD序列下游
AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）
（4）转录终止子
终止子对外源基因的表达同样起着非常重要的作用,它能有效 控制目的基因 mRNA的长度,提高mRNA的稳定性,避免质粒上其他 基因的异常表达。
第八章 外源基因的表达系统
第一节 基因表达的机制 第二节 外源基因表达系统
表达系统
克隆的基因只有通过在宿主细胞中表达才能进一步 研究其功能和调控机理，同样，也只有通过其表达 才能获得具有特定生物活性的目的产物。这种表达 外源基因的宿主细胞就叫表达系统，它可分为原核 (主要是大肠杆菌)表达系统和真核(酵母、昆虫细胞、 哺乳类动物细胞、植物细胞)表达系统两类。要使克 隆基因在宿主细胞中表达，就要将它插入带有基因 表达所需要的各种元件的载体中，这种裁体就称为 表达载体。对不同的表达系统，需要构建不同的表 达载体。
② -10box（Pribnow Box）
5’-TATAAT-3’
5’ TTGACA
TATAAT 转录起始位点
17bp
核糖体结合位点
原核启动子共有序列的功能
（3）翻译的起始位点
①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site
1）Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 SD mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——
mRNA有效翻译须考虑的基本原则
①AUG(ATG)是首选的起始密码子。 ②SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点， 该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。 ③SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9 个碱基。 ④在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二 级结构。
对于真核细胞mRNA的5‘非翻译区不存在SD序列， 但绝大多数mRNA的起始序列都含有共同的序列 5’-CCA(G)CCATGG-3‘，如果改变这一序列，可使 翻译的起始效率大大降低。此外， 在起始密码 ATG的上游区域含有另一个起始密码而又不被随 后的一个符合阅读框的终止密码所终止，则该起 始密码会影响mRNA翻译的起始。
另一方面，存在正常转录终止序列也是外源基因有效表 达的重要因素，它可以防止产生不必要的转录产物，使 mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表 达的稳定性。 对于真核细胞来说，表达载体上含有转录终止序列和 poly(A)掺入位点是外源基因表达的重要条件。poiy(A) 掺入的信号序列AAUAAA对 mRNA3‘端的正确加工至关重 要，AAUAAA位点的缺失甚至可以导致基因表达的减少。
5 目的基因沉默
基因沉默(gene silencing)是导致外源基因不 能正常表达的重要因素。其作用机制主要有三 种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉 默和转录后水平的基因沉默。基因沉默现象主 要表现在转基因植物和转基因动物中。
5.1 位置效应
是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。 在植物和动物转基因中，外源基因进入细胞核 中并整合到染色体DNA上，其整合的位点与基 因的表达密切相关。如果外源基因整合到甲基 化程度高、转录活性低的异染色质上,一般不 能表达;