TLRs信号转导通路及负调控分子研究进展

综论与综述H A I X I A K E X U E TLR s信号转导通路及负调控分子研究进展*
福建医科大学基础医学院聂惠蓉泉州师范学院生物学系李裕红福建医科大学基础医学院刘迎春
[摘要]生物机体存在着多种T LR s的负调控机制，以维持免疫反应的平衡。

该文综述了Tol l样受体（Tol l-l i ke r ecept or s, T LR s）的结构、分布及主要的内源性和外源性配体，重点阐述T LR s信号通路的类型和转导机制，并分析论述TLR s信号通路中的负性调控分子。

[关键词]TLR s信号转导通路负调控分子
Toll蛋白最早发现于果蝇胚胎发育过程中,在背腹侧体轴细胞的形成过程中起重要调控作用[1,2]。

Toll样受体是一类病原相关模式识别受体（PRR），该家族与果蝇的Toll蛋白家族在结构上有高度同源性。

TLRs广泛表达于哺乳动物等细胞表面，是一种跨膜信号转导蛋白。

通过识别微生物的PAMPs或自身的内源性配体激活胞内信号通路，从而诱导产生促炎性细胞因子、趋化因子、干扰素和共刺激因子，在机体识别和清除病原微生物、介导下游细胞因子产生、天然免疫防御、连接先天性和获得性免疫中发挥重要作用。

1TL R s的结构、分布及配体研究
1.1TL R s的结构与在细胞内的定位
TLRs属于I型跨膜受体，由胞外区、跨膜区和胞内TIL(Toll/IL-R1)区组成。

胞外区富含亮氨酸重复序列，约550～980个氨基酸，可识别病原微生物的PAMPs；跨膜区是富含半胱氨酸的区域；胞内TIL(Toll/IL-R1)约有200个氨基酸,为所有TI R及IL-l R分子胞内段所共有。

该结构域可以与胞内其他带有相同TI R结构域的分子发生相互作用，启动信号传递，是信号传导的主要区域[3]。

目前，在人体中相继发现了11个TLRs，即TLR1～11,小鼠中不表达TLR10但发现了人没有的TLR11～13[4]。

根据TLRs细胞内定位的不同，可将其分为两类，即位于细胞膜表面的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TTLR11和位于细胞内细胞器膜(如细胞内体、溶酶体或内质网膜)的TLR3、TLR7／8和TLR9。

胞内细胞器膜的TIRs识别病毒和细菌的核酸。

当细胞通过自吞噬作用将病毒粒子吞入细胞后，被细胞内体或溶酶体融合并将衣壳降解导致其核酸释放，从而被TLRs识别[5]。

此外，研究证明，定位于胞内的TLRs对于识别病毒RNA、DNA 和自身的RNA、DNA是十分重要的。

例如，当TLR9的跨膜区和胞质区与TLR4发生替换时，产生的嵌合蛋白(TLR9N4C)被置换到质膜上[6]。

这种嵌合蛋白能够识别病毒和细菌的CpG DNA，却不能识别自身的DNA。

值得注意的是，这种嵌合蛋白表达于巨噬细胞表面，这些细胞可以识别自身的DNA。

由于对自身DNA的异常识别是引起自身免疫性疾病的原因。

因此推断，TLR定位于胞内可防止自身免疫性疾病的发生。

1.2TLR s的配体
TLRs的基因分散地分布在不同的染色体中，其中TLR1、TLR2、TLR3和TLR6基因定位于4号染色体，TLR4和TLR5基因分别定位于9号和1号染色体，TLR7和TLR8基因定位于染色体Xp22，TLR9基因定位于3p21.3。

TLR11为TLRs 家族新成员，主要表达于泌尿系统。

TLRs的配体按其来源可分为内源性和外源性配体（见表1）。

内源性配体主要是宿主的成分,如热休克蛋白、细胞外基质降解成分等。

外源性配体主要是微生物进化过程中的保守成分,如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等。

表1T LR s的配体及其来源[3~7]
受体配体来源
TLR1
TLR2
TLR3
TLR4
TLR5
TLR6
TLR7/8
TLR9
TLR10
三脂酰脂肽
肽聚糖、胞壁酸
非典型的脂多糖
脂蛋白
酵母多糖
热休克蛋白70
双链RNA
Poly:C
Ⅰ
LPS
紫杉醇
热休克蛋白60/70
鞭毛蛋白
二脂酰脂肽
胞壁酸
酵母多糖
单链RNA(ssRNA)
未甲基化的CpGNA模序
三酰基脂肽
细菌（G+、G-）、分支杆菌
革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌
分枝杆菌
真菌
宿主
病毒
合成化合物
革兰氏阴性菌
植物
宿主
细菌
支原体
革兰氏阳性菌
真菌
病毒
细菌或病毒
未知
*基金项目：福建省自然科学基金资助项目（2009J05068），通讯作者：刘迎春。

2TL R s的信号转导通路
Toll样受体可在多种免疫细胞中表达，如单核细胞／巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞及未成熟树突状细胞，还可在血管内皮细胞、心肌细胞和肠上皮细胞表达。

TLRs识别并结合PAMPs或内源性配体导致下游信号事件和转录因子的激活，从而诱导抗微生物分子、化学趋化因子、细胞因子和共刺激分子的表达。

据研究报道，主要有两条信号通路途径，一是依赖于髓样分化因子88（MyD88）信号转导途径，另一是非依赖于髓样分化因子88（MyD88）信号转导途径。

除TLR3外，所有的TLRs都可以通过MyD88介导下游的信号转导。

2.1M yD88依赖的TLR s的信号转导途径
My D88是一种35k Da的胞浆内蛋白质，为TLRs信号途径中普遍存在的接头分子，同时也是TIR／IL-1R超家族的重要成员之一。

它的C端含TIR结构域，与TLRs胞内区的TIR结合，N端则是死亡结构域(death domain，DD)。

TLRs 与My D88的结合后，招募IRAKs(interleukin receptor associated kinase)家族，包括IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M。

其中IRAK4是激活依赖于MyD88不可缺少的关键分子[8,9]，一旦IRAK4被磷酸化，就会与MyD88分子分离，进而与TRAF6(TRAFs家族成员)发生相互作用。

TRAK1与TAB1、2、3结合活化两条下游途径，其中包IKK(IKBkinase)复合体和MAPK(mitogen-activated protein kinase)家族。

IKK 复合体由具有催化作用的IKK-d、IxB、IKK-p和IKK-y/NEMO 亚基组成，它可以催化IкB蛋白磷酸化。

这种磷酸化可引起IкBs的降解以及NF-кB的激活是不可或缺的；而MAPKs的磷酸化则激活转录因子AP-1(activator protein-1)。

AP-1是来源于Jun、Fos、ATF和Maf等分子的一段富含亮氨酸的二聚体，而c-Jun基因在TLRs激活炎性细胞因子的信号转导通路中起到重要作用。

对来源于TAK1缺陷性小鼠的细胞研究发现，TLRs信号通路中的NF-кB与MAPKs的激活受到抑制，炎性细胞因子的表达也进一步下调[10]。

这表明，AK1在NF ~кB与MAPKs活化的信号转导通路中起到不可替代的作用，但TAK1(TGF-b-activated kinase1)如何活化IKK复合体和MAPKs，却仍然不清楚。

对TAK1泛素化的研究发现，尽管Ubcl3(ubiquitin-conjugating enzyme)与NF~кB和MAPKs的激活有关，但在Ubc l3缺陷型小鼠，它对NF~кB的激活可有可无。

Ubc l3缺陷型巨噬细胞，在各种TLRs配体刺激下显示出缺乏产生炎性细胞因子的能力，即MAPKs的激活受到抑制，而NF~кB 的激活却未受到影响，这表明Ubcl对MAPKs的激活是必要的。

值得关注的是，Ubcl3的缺乏对TAK1的活化和TRAF6的泛素化不产生影响。

在TLRs通路中，由于TAK1和TRAF6对MAP Ks和NF~кB的激活十分重要。

因此，推断Ubcl3对MAPKs激活通路是不依赖于TAK1和TRAF6，它位于TAK1/TRAF6的下游。

在Ubc l3缺陷型细胞中，当Ubc l3缺乏时，Ubc5就会激活NF~кB，特别是IKK-7/NEMO的泛素化显著降低。

这预示依赖于Ubcl3的IKK-7/NEMO (NF~кB essential modulator)的泛素化和MAPKs的活化之间存在一定的联系[11]。

除TAK1之外，还有其他的MAPKs与TLR4信号通路有关。

当受到LPS刺激后，MEKK3缺陷型巨噬细胞并不能激活JNK和p38产生IL-6[12]。

与之相反，虽然Tpl-12缺陷的巨噬细胞受到LPS刺激后ERK的活化与TNF-α的表达受到严格的抑制，但能够激活，JNKs(c-Jun N-terminal kinases)和p38。

研究表明，ABIN2(一种捆绑A20分子的NF~кB抑制剂)能稳定Tpl-12对ERK的激活。

对ASK1缺陷型脾细胞和DC的研究表明，p38活化以及IL-6、TNF-α的分泌受到抑制。

LPS刺激ROS的表达与TRAF6-AS K1-p38信号通路的建立有关[13]。

总之，MAPKs的激活决定了TLR4介导的炎症反应。

2.2M yD88非依赖的TLR s的信号转导途径
MyD88基因敲除鼠在应答TLR2、TLR7和TLR9配体时未发现NF~кB和JNK的活化。

然而，关于TLR4的刺激，虽然MyD88基因敲除的细胞在应答LPS时不产生任何炎症细胞因子，但却可以观察到LPS诱导的NF~кB和JNK的延迟活化。

Kawai等[14]分别从有LPS刺激和无LPS刺激的敲除MyD88基因的巨噬细胞中提取mRNA，发现存在LPS刺激时，MyD88基因敲除细胞有IFN诱导的基因的表达，如IP-10和GARG16。

后来的系列研究充分证实，存在MyD88依赖和MyD88非依赖两条TLRs信号途径。

在MyD88非依赖信号途径中，LPS的刺激，使转录因子干扰素调节因子3 (interferon regulate factor3，IRF3)活化，诱导IFN-13表达。

IFN-13再依次激活Statl,进而导致几个IFN诱导的基因的表达[15]。

研究显示，在MyD88基因敲除细胞，除TLR4配体，TLR3配体dsRN A亦可活化NF~кB。

病毒和病毒衍生dsRNA 是IRF-3的有效激活子，活化的IRF-3启动IFN-β基因表达。

故TLR3配体dsRNA能激活MyD88非依赖途径，在此途径中，IRF-3发挥着重要作用。

那么哪些激酶负责IRF-3的活化呢?Sharm等[16]采用酵母双杂交技术筛选了与IRF-3相互作用的分子，发现IRF-3和IкB激酶(IкB kinases，IKKs)密切相关。

IKKs由IKKα和IKKβ组成，两者均磷酸化IкBα的Ser32和Ser36，诱导NF~кB活化。

此外，有两个非经典的IKKs：TRAF联合NF~кB激酶(TRAF joint NF~кB kinase，
综论与综述H A I X I A K E X U E
TANK)结合激酶1(TANK-binding kinase1,TBK1)和IKKε／IKKi。

与经典的IKKα和IKKβ比较，具有不同的激酶活性。

体外激酶分析发现TBK1和IKKε／IKKi能够诱导IRF-3磷酸化；用RNA干扰介导技术删除TBK1和IKKε／IKKi后，病毒诱导的IRF-3磷酸化则被抑制。

Fitzgerald和同事[17]也发现TBK1和IKKε／IKKi能活化IRF-3、诱导IFN-β表达；当通过RNA干扰作用降低TBK和IKKε／IKKi表达，则发现应答病毒和dsRNA时，IFN-β表达受损。

所以，应答TLR3配体时，TBK1和IKKε／IKKi发挥关键作用。

值得注意的是，K63多泛素作用在IRF活性中同样发挥重要作用，Zeng等[18]研究发现内源性泛素K63R突变会导致病毒活化的IRF3失活。

3TL R s信号通路中的负性调控因子
TLRs的激活一方面可刺激先天性和获得性免疫反应来保护机体，但另一方面如引起持续炎症反应则会对机体产生损伤。

自身免疫、慢性炎症和感染性疾病均与它有一定的关系。

例如LPS持续刺激TLR4会产生严重的败血症和感染性休克。

此外，类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺心病、结肠炎、哮喘、肌病、红斑狼疮和动脉粥样硬化等也与TLRs的激活有关。

因此，TLRs的激活必须受到严格的负向调控，以保持机体免疫系统的稳定[19]。

3.1I R A K-M和Tol l i p分子
适当的炎症反应可以有效地清除入侵的病原微生物保持机体健康，但是免疫系统过度活化对机体有害无益，在某些情况下超量的细胞因子会引发严重的炎症反应,引起组织损伤甚至循环衰竭,导致死亡。

如上所述，IRAK-M通过抑制IRAK与TLR受体复合物的解离，对巨噬细胞TLRs活化信号起负调控作用。

除此之外，静息细胞中Tollip分子与IRAK 形成复合物，可通过抑制IL-1和TLRs介导的IRAK磷酸化抑制细胞活化[20,21]。

3.2M yD88s分子
MyD88s(MyD88short)是MyD88分子的差异剪切体，主要表达在脾细胞，单核细胞受LPS刺激后，可上调MyD88s 的表达。

MyD88s虽可结合IL-1R和IRAK，但不能诱导IRAK 磷酸化和随后的NF~кB活化；相反，它能阻止IRAK-4与TLR受体复合物的结合，对TIRs和IL-1活化信号起负调控作用[22,23]。

3.3SIG I R R分子
SIGIRR(Single immunoglobulin IL-1R-related molecule)又称Tir8(Translationiniia-tionregion8),基因定位于染色体11p15.5，为单链Ig/I L-1R相关受体超家族成员，含Ig和TIR两种功能域,但TIR中无传递信号所必需的保守氨基酸Ser447和Tyr536[8]。

SIGIRR主要表达在上皮细胞和树突状细胞，高表达SIG IRR的293细胞能有效抑制IL-1和IL-18诱导的NF~кB报告基因转录活性；SIGIRR基因缺陷可使LPS 和CpG诱导DC分泌更多的细胞因子和趋化因子，但对TNF -α诱导的DC活化无影响。

因此它是TLR/IL-1R的负性调控因子,并主要在调控胃肠道系统的炎症反应中起重要作用[24]。

IL-1作用于细胞后，SIGIRR与IRAK和TRAF6结合，提示SIGIRR通过与IL-1受体复合物结合发挥负性调节作用[25]。

相对于IRAK-M、tollip和MyD88s等TLRs信号的胞内抑制性分子,SIGIRR为胞外抑制性分子，因此胞内以及胞外抑制性分子之间的协同作用，共同对TLRs活化进行精细的调节。

3.4其他的负调节分子
除上述分子，PI3-K(Phospho inositide3-kinase)和SOCS -1(Suppressor of cytokine signaling-1）也参与对TLR信号的负调节[26]。

PI3-K是TLR2诱导IL-12分泌的内源性抑制分子，在细胞中组成性表达,被认为在TLR信号的早期阶段或第一次接触病原体时发挥作用；而IRAK-M和SOCS-1可被TLR诱导表达，因此在二次刺激或病原体持续存在时发挥负调节作用，与LPS耐受的形成有关。

机体还可通过下调细胞TLR4表达水平诱导LPS耐受，降低对LPS的反应性[27]。

4小结
当病原微生物感染时，机体的TLRs通过复杂的、多层次的调控来实现其介导的信号转导。

首先，TLRs与胞内的接头分子相互作用激活多条信号转导通路，启动机体的先天性免疫反应和促进获得性免疫反应，产生炎症反应，清除病原微生物。

其次，机体通过启动自身的负向调控系统来抑制TLRs信号转导通路，使机体恢复免疫平衡。

深入研究TLRs 的结构和信号转导途径，以及它们与免疫细胞的相互作用，探讨可能的干预及治疗措施，可为相关疾病的临床治疗和用药提供新的靶位点。

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