遗传病的分子诊断

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限制性内切酶分析法
利用内切酶MstⅡ消化待检的DNA样品
正常的βA和突变的βS第5-7位密码子序列：
正常βA ：CCTGAGGAG
突变βS ：CCTGTGGAG
第6位密码A变成T，使Mst II不能识别
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(四)X连锁显性遗传病的分子诊断
脆性X综合征 (fragile X syndrome, FraX)
• 该策略的关键是DNA标志物
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从候选基因入手
将某一疾病基因初步定位
以该区域中已克隆的无名基因、cDNA等为候选者 根据定位结构是否相同来鉴定疾病相关基因
此方法具有速度快、效率高的优点
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(2)基因诊断的途径
• 确定单基因遗传疾病后，再确定基因检测的方法 • 采集先证者及其父母的DNA；携带者基因分析时，需 采集与患者、携带者有血缘关系的亲属样品 • 从人体组织的有核细胞中提取分离DNA
基因诊断是当前诊断遗传病最精确的方法
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(1) 基因诊断的思路
• 从蛋白质入手
– 从蛋白质到核酸，由表型至基因型
• 从DNA入手
– 由DNA到蛋白质
• 从候选基因入手
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从蛋白质入手明确蛋白产物
测定蛋白质的氨基酸序列
合成DNA探针
筛选编码基因或cDNA克隆
DNA测序确定导致疾病的分子缺陷
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从蛋白质入手
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2. 脆性X智力障碍基因的突变特征
FMR-l基因5’端外显子上的非翻译区有一(CGG)n重 复序列的多态性结构，正常人群 (CGG)n重复次数 在6～50之间
1)FMR-1基因(CGG)n重复序列异常扩增
前突变：(CGG)n重复数为50～200 全突变：(CGG)n重复数>200
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2. 脆性X智力障碍基因的突变特征

致病基因位于常染色体 一对等位基因中只要有一个致病基因就可表现出 基本性状 男女患病机会相等
如：先天性软骨发育不全病、亨廷顿病
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(2) 常染色体隐性遗传
(autosomal recessive inheritance, AR)
致病基因位于常染色体
携带一个隐性致病基因的杂合子不表现症状，只有获得 一对隐性基因的纯合子才表现出相应症状
由同一或不同基因座的不同突变所致的非常类似 的表型 同一种表型可由多个不同的基因型控制
大多数遗传病都有遗传异质性
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遗传异质性
1) 等位基因异质性
由同一基因座不同突变所致非常类似的表型 β地中海贫血可由100多种突变引起
2) 基因座异质性
由不同基因座不同突变所致非常类似的表型
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4.单基因遗传病基因诊断中存在的问题
③ 三核苷酸重复突变
④ 基因部分片段重复转录，基因产物大小改变 ⑤ 插入突变，基因组其他部位的DNA片段插入到目的 DNA序列内
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2.单基因遗传病的分类
(1) 常染色体显性遗传
(2) 常染色体隐性遗传
(3) X连锁显性遗传
(4) X连锁隐性遗传
(5) Y连锁遗传
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(1) 常染色体显性遗传
(autosomal dominant inheritance, AD)
– 限制性内切酶分析
– 脉冲场凝胶电泳 – 荧光原位杂交技术(FISH)
– 多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)
– 微阵列比较基因组杂交技术(array-CGH)
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3. DMD/BMD的基因诊断方法
(2) 基因点突变的检测
– 变性高效液相色谱分析(DHPLC)
– 单链构象多态性分析(SSCP)
2) PCR方法
• 扩增(CGG)n重复序列，检测扩增片段长度 • 嵌合体患者有较小的(CGG)n片段，也有PCR扩增产 物，可导致假阳性
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(五)X连锁隐性遗传病的分子诊断
Duchenne肌营养不良(DMD)和Becker肌 营养不良(BMD)
• X连锁隐性遗传性疾病，主要累及男性个体
• Xp上抗营养不良蛋白(dystrophin)基因突变引起 的一组肌肉疾病
镰状细胞贫血 (sickle cell anemia, 来自百度文库CA)
• 常染色体隐性遗传病 • 血红蛋白基因突变导致镰状血红蛋白(HbS)取 代正常血红蛋白(HbA) • 热带非洲黑人发病率高达40％
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1.镰状细胞贫血的遗传学发病机制
• 珠蛋白基因第6位密码子GAG变为GTA，HbA的 β链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成HbS • 缺氧时，HbS溶解度降低，在细胞内聚合，红细 胞变形扭曲成镰刀状
– 外周血有核细胞、口腔黏膜、毛囊细胞
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(2)基因诊断的途径
• DNA印迹法(Southern blotting)
分析基因或基因片段的缺失、插入或动态突变
• PCR及其衍生技术
分析核苷酸取代、缺失或插入造成的点突变
• 基因芯片技术
自动化、微量化、高通量
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4.单基因遗传病基因诊断中存在的问题
(1) 遗传异质性(genetic heterogeneity)
男女受累机会均等
如：苯丙酮尿症、白化病
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(3) X连锁显性遗传
(X-linked dominant inheritance, XD) 致病基因位于X染色体 以显性遗传的方式向后代遗传 男性患者的女儿全部为患者，儿子全部正常，女性患者 的子女中各有50％可能性是患者 如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、假性甲状腺功能减 退病
遗传性疾病的分子诊断
李世宝
sdjnshlb@163.com
概 述
遗传性疾病
是由遗传物质改变所导致的疾病或缺陷，按一定 的方式垂直传递。 • 我国每年新出生人口中6％患有不同的遗传病， 新增遗传病患儿约120万 • 遗传病的发病率逐渐升高
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遗传病的分类
单基因遗传病
• 基因病
多基因遗传病
• 染色体病 • 体细胞遗传病
– 异源双链多态分析(HA) – 化学错配碱基裂解法(CMC) – RT-套式PCR – 截短蛋白试验和直接测序
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3. DMD/BMD的基因诊断方法
(3) 基因检测应注意的问题
• 检测技术尚难在一般实验室普及 • 检测中应注意设置对照，做好质量控制
• 检测前与患者沟通
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二、多基因遗传病的分子诊断
(2) FMR-1基因5’端CpG岛的异常甲基化
FMR-1转录受抑制或减弱，FMRP表达受阻
(3) FMR-1基因的缺失和点突变
FMR-1基因的错义突变和缺失型突变影响 FMRP的正常结构
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3.1) 脆性 X 综合征的基因诊断方法 Southern blot分析
• 检测(CGG)n的拷贝数和甲基化状态 • 确认全突变与前突变 • 适用于患者及携带者的诊断
(Y-linked inheritance, YL)
致病基因位于Y染色体 伴随Y染色体以显性遗传方式向男性后代传递 只有男性才表现出相应性状
如：外耳道多毛症
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3.单基因遗传病的基因诊断
• 表型诊断
根据症状体征来判断病因并诊断
• 分子诊断（基因诊断）
直接检测患者基因(DNA)或其转录产物(mRNA)诊 断疾病
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1. Dystrophin基因
Dystrophin基因定位于Xp21，长达2 400 kb， 有79个外显子
DMD：dystrophin基因表现为显著丢失甚至 缺失，临床症状较重 BMD：dystrophin基因结构发生改变，但能 够指导合成蛋白，症状较轻
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2. Dystrophin基因的突变特征
• 基因突变率较高 • 基因突变形式多样
缺失、点突变、重复、微小缺失或微小重复
• 缺失和重复的热点
1) Dystrophin基因5’端和中央区 2) 小突变位于dystrophin基因的非编码区
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3.(1) DMD/BMD 的基因诊断方法 基因缺失的检测常用方法
– Southern印迹法
– 多重PCR – 定量PCR
• 位于染色体4p16.3，由67个外显子构成，编码产生蛋白质 huntingtin • IT15基因外显子1的起始密码子ATG下游17个密码子处有 一段多态性的CAG重复序列，转录翻译产生一段聚谷氨酰 胺连于huntingtin蛋白的N端
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2. ITl5基因在HD中的变化
• 正常IT15基因的(CAG)n重复长度为9～34个重复单位 • HD患者n>36，最多超过120 • 疾病状态下，IT15基因(CAG)n重复的多少与发病的早 晚、疾病的严重程度呈正比
多基因遗传表型受环境因素的影响，是基因与环境结合 形成的一种性状
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2.(1) 多基因遗传病的分子诊断策略 基因直接检测法
适用于已知基因异常的疾病
(2) 基因间接检测法
适用于致病基因已知，但其异常未知；或 致病基因本身未知 对受检者及其家系进行连锁分析，推测受 检者是否获得致病基因
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2. 多基因遗传病的分子诊断
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2 镰状细胞贫血的基因分型
纯合子(βSβS)型
没有正常的血红蛋白，病情严重
杂合子(βAβS)型
镰状细胞基因携带者，一般无异常表现，仅在低氧情 况下出现镰状红细胞
双重杂合子型
临床症状轻微
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3. 镰状细胞贫血的基因诊断方法
• 限制性内切酶分析法
– 限制性内切酶MstⅡ
• DNA印迹法 • 等位基因-RFLP连锁分析
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3.亨廷顿病的基因诊断方法
基因诊断主要检测(CAG)n重复次数
• 普通PCR：检测出重复次数较少的小片段
• Southern印迹法：分析重复次数很大的样本
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(三)常染色体显性遗传病的分子诊断
镰状细胞贫血 (sickle cell anemia, SCA)
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(三)常染色体显性遗传病的分子诊断
• 糖尿病的分子诊断
• 冠心病的分子诊断 • 阿尔茨海默病的分子诊断
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(4) X连锁隐性遗传
(X-linked recessive inheritance, XR)
致病基因位于X染色体
女性在纯合子时表现出相应性状；携带一个隐性致病基 因时，为表型正常的致病基因携带者
男性X染色体上有一个隐性致病基因就会发病
如：甲型血友病、红绿色盲
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(5) Y连锁遗传
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1.多基因遗传病的概念
多基因遗传(polygenic inheritance)
指生物和人类的许多表型性状由不同座位的较多基因 协同决定，而非单一基因的作用。
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2. 多基因遗传特点 基因微效性
多基因遗传时，每对基因的性状效应是微小的
协同作用
不同微效基因可协同累加作用，导致表型产生
环境因素
• X连锁显性遗传病 • 最常见的遗传性智力障碍 • 男性群体中的发生率为1/2000～1/1000，男、 女患病的比率为2:1
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脆性X综合征
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1. 脆性X智力障碍基因的结构与定位
• 脆性X基因(FMR-1)缺陷使FMR-1蛋白(FMRP)生成减 少或缺乏，导致脆性X综合征 • FMR-1基因位于Xq27.3，在基因组中跨越38 kb，由17 个外显子和16个内含子组成
• 通过该策略诊断许多单基因遗传疾病
– 白化病 – 苯丙酮尿症 – 镰状细胞贫血
• 该策略已较少采用
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从DNA入手
连锁分析确定致病基因的染色体定位
在该区域内搜索、分离致病基因
找到导致遗传病的分子缺陷
阐明正常与异常基因产物的生理功能和病理效应
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从DNA入手
• 当前遗传性疾病诊断的主要策略
– 杜氏肌营养不良 – 亨廷顿舞蹈病
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一、单基因遗传病的分子诊断
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定义
单基因遗传病 (monogenic disease) 指单个基因突变所引起的遗传病。 特点：
– 病种较多，单个疾病发病率低 – 临床表现复杂多样
– 遗传规律符合孟德尔定律
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1.单基因遗传病发病的分子机制
单基因遗传病的基因突变类型
① 基因的外显子或内含子完全或部分缺失 ② 基因的单碱基突变
(2) 基因突变的多样性
• 基因突变包括缺失、插入、替换和动态突变等
(3) 临床诊断是基因诊断的基础
• 基因诊断前注意临床诊断的准确性
• 多数遗传病需依靠多态性标志物进行家系连锁分 析，确定疾病相关基因
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4.单基因遗传病基因诊断中存在的问题
(4)基因诊断方法的选择
根据基因诊断的目的慎重选择方法 产前诊断时，应选择高特异性和高灵敏度的方法， 可同时应用两种以上原理不同的方法进行检测， 减低误诊率
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(二)常染色体显性遗传病的分子诊断
亨廷顿病 (Huntington disease, HD)
• 常染色体显性遗传病 • 常于30～45岁缓慢起病，临床表现为进行性加重的 舞蹈样不自主运动和智能障 • 患者大多有家族史，患病率为5/10万～10/10万
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1.HD基因的结构与定位
亨廷顿病相关基因ITl5 (interesting transcript 15)