联苯菊酯的抗雄激素作用及其机制
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毒理学杂志 2006 年 10 月第 20 卷第 5 期 J Toxicol October 2006 Vol120 No15 中图分类号 :R994 文献标识码 :A 文章编号 :1002 - 3127 (2006) 05 - 0305 - 03
联苯菊酯的抗雄激素作用及其机制
·305 ·
【关键词】 环境抗雄激素 ;联苯菊酯 ; Hershberger 试验 ;报告基因试验
The antiandrogenic effect and mechanism of bifenthrin
ZHU Wei , ZHENG Yi2fan , ZHU Hui2juan , ZHU Xin2qiang ( Department of Toxicology , School of Public Health , Zhejiang University , Hangzhou Zhejiang 310031 ,China)
【 Key words】 Environmental antiandrogen ; Bifenthrin ; Hershberger assay ; Reporter gene assay
近十多年来 ,有关人类和野生动物暴露于环境内 分泌干扰物可能导致内分泌功能紊乱 、生殖和发育异 常等潜在危害一直受到人们的关注 ,目前至少已经发 现有上百种环境内分泌干扰物 ,其中主要是环境雌激
【Abstract】 Objective Herein we conducted in vivo and in vitro assays to investigate the antiandrogenic actitivity and mechanism of bifenthrin. Method Hershberger assay was used to determine the antiandrogenic potential of bifenthrin in vivo. Six2week2 old castrated male SD rats were randomly divided into six groups , each of which consisted of five rats. Each group of rats were administrated once daily for 7 days with testosterone propionate (TP) (100μg ,sc) ,excluding an additional group without TP ,plus gavage dosage of bifenthrin (115 ,415 and 1315 mgΠkg) ,flutamide (50 mgΠkg) ,while hormone deficient control and vehicle control groups of rats were gavaged with same volumes of corn oil. After 72day treatments ,all rats were euthanized and the liver ,kidney , spleen ,ventral prostate ,seminal vesicle were excised and weighed respectively. Transcriptional activation assay was used to determine the mechanism. Cells stably expressing an androgen2responsive reporter (AR) gene ,MDA2kb2 ,were treated with various concentrations of bifenthrin or known antiandrogen hydroxyflutamide with adding dihydrotestosterone (DHT) at the same time. Cells were lysed after incubation ,and then luciferase activity was measured. Finally the fold inductions over vehicle control were calculated as standard luciferase activity value , which represents antiandrogenic potency. Results In in vivo assay ,compared with vehicle control , bifenthrin at dose of 1315 mgΠkg caused significant decrease in some major androgen2responsive tissues ;while in in vitro assay ,it could block DHT2induced AR activity in MAD2 kb2 cells in a dose2dependent manner. Conclusion Bifenthrin is an environmental antiandrogen , and AR antagonism may contribute to its antiandrogenic activity ,which may occur before significant general toxicity presents.
·论著·
朱威 ,郑一凡 ,祝慧娟 ,朱心强 (浙江大学医学院预防医学系毒理学教研室 ,浙江 杭州 310031)
【摘要】 目的 探讨联苯菊酯的抗雄激素作用及其可能机制 。方法 体外雄激素受体 (AR) 依赖转录活化试验中 , 在 96 孔板上接种稳定表达荧光素酶报告基因的 MDA2kb2 细胞 ,加入联苯菊酯或已知抗雄激素 ,同时加一定剂量的双氢 睾酮 (DHT) 以诱导荧光素酶基因的表达 ,裂解细胞后测定荧光素酶活力值 ,以溶剂对照组的倍数比值作为标化荧光强度 单位 ,此值高低表示抗雄激素作用的大小 。体内 Hershberger 试验中 ,将去势的 30 只雄性大鼠随机分为联苯菊酯低 、中 、 高剂量 ,阳性对照 、溶剂对照和睾酮缺乏共 6 组 ,每组 5 只 。除睾酮缺乏组外每天皮下注射丙酸睾酮 (TP) 100μg ,连续7 d ; 给药组 、阳性对照组 、溶剂对照和睾酮缺乏组分别同时灌胃给予联苯菊酯 115 、415 和 1315 mgΠkg、氟他胺 50 mgΠkg、以及同 体积花生油 。7 d 后处死大鼠并称重雄激素依赖组织 。结果 Hershberger 试验中联苯菊酯 1315 mgΠkg 剂量组大鼠的精囊 腺 、腹侧前列腺等主要雄激素依赖组织重量与溶剂对照组比较 ,差异有统计学意义 ( P < 0105) ,但未出现明显的一般毒性 反应 。报告基因试验中 ,联苯菊酯 110 ×10 - 8 、110 ×10 - 7 、110 ×10 - 6 、110 ×10 - 5 molΠL 能拮抗 DHT 的荧光素酶诱导作用 ( P < 0105) ,呈剂量2效应关系 。结论 证实联苯菊酯是一种环境抗雄激素 ,其作用可发生在一般毒性之前 ,AR 拮抗可能 是其作用机制之一 。
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·306 ·
毒理学杂志 2006 年 10 月第 20 卷第 5 期 J Toxicol October 2006 Vol120 No15
于联苯菊酯与氯菊酯具有相似的化学结构及广泛的应 用 ,本实验通过体外和体内试验相结合的方法 ,研究其 是否具有抗雄激素作用及其可能的作用机制 。
1 材料与方法 111 试剂 Leibovitz’s L215 培养基 ( 美 国 Gibco 公 司) ,含 100 UΠml 青霉素钠 、100μgΠml 链霉素 、0125μgΠ ml 两性霉素 B ,胰蛋白酶 ,MTT(上海生工) ,羟基氟他 胺 (复旦大学药学院 ,纯度 > 99 %) ,丙酸睾酮 (上海通 用药业股份有限公司) ,双氢睾酮 (美国 Fluka 公司 ,编 号 :10300 ,纯度 > 99 %) ,荧光素酶测定试剂盒 (美国 Sigma 公司) ,氟他胺 (上海复旦复华药业有限公司) ,睾 酮测定放射免疫试剂盒 (天津德普公司) 。 112 细 胞 MDA2kb2 细 胞 ( 美 国 ATCC) , 培 养 在 37 ℃、无 CO2 细胞培养箱中 。 113 动物 清洁级 3 周龄 SD 雄性大鼠 30 只 ,体重 50 ～70 g ,由浙江省实验动物中心提供 ,合格证号 :20032 0001 。 114 雄激素受体报告基因试验 联苯菊酯的剂量为 110 ×10 - 8 、110 ×10 - 7 、110 ×10 - 6 、110 ×10 - 5 molΠL 。以 110 nmolΠL DHT 为 AR 激动剂对照 ,110 nmolΠL DHT + 1 μmolΠL OHF 为拮抗剂对照 ,1∶1 000的无水乙醇与 L215 培养液之混合液为相应的溶剂对照 ,每种处理各设 4 个平行样 。培养 24 h 后倒去受试液 ,用 PBS 轻轻洗涤 1 次 ,然后每孔加入 25μl 1 ×细胞裂解液 ,继续培养 15 min 以上直至细胞裂解完全。将荧光素酶测试缓冲液与 测试底物混合 ,平衡至室温 ,各孔依次加入 100μl 荧光 素酶测试液 ,测定荧光素酶活力值。 115 Hershberger 试验 将经去势的大鼠按体重随机 分为溶剂对照 ,睾酮缺乏 ,阳性对照 ,联苯菊酯高 、中 、 低剂量组共 6 组 ,每组 5 只 。除睾酮缺乏组 (只给予同 体积花生油) 外 , 每 只 动 物 每 天 皮 下 注 射 丙 酸 睾 酮 (TP ,100μg ,溶于 012 ml 花生油) ,连续 7 d 。实验组和 阳性对照组分别同时灌胃给予联苯菊酯 115 、315 、1315 mgΠ(kg·d) 和已知抗雄激素氟他胺 50 mgΠ( kg·d) ;溶剂
对照组和睾酮缺乏组同时灌胃给予同体积花生油 。每 天观察大鼠 2 次 ,一般情况 、中毒症状和死亡情况以及 食物利用等 。最后 1 次给药 24 h ,用戊巴比妥钠麻醉 后股动脉放血处死 ,收集血液并制备血清 , - 20 ℃保 存 ,采用放射免疫试剂盒测定血清睾酮水平 。取肝 、 脾 、肾 、肾上腺 、精液囊 (包括凝集腺及液体) 和前列腺 、 肛提肌加球海绵体肌 (LABC) 、尿道球腺 、阴茎头 、包皮 腺并称重 。 116 统计学方法 数据以 x ±s 表示 。采用单因素方 差分析 ,秩和法检验 。
作者简介 :朱威 ,在读硕士生 ,研究方向 :生殖毒理学 。 通讯作者 :朱心强 ,教授 ,医学博士 ,研究方向 :生殖毒理学 。
素和环境抗雄激素[1] 。在已确认或可疑的环境抗雄激 素中数量最多的是农药 ,包括杀虫剂 、杀菌剂和除草剂 等[2] 。联 苯 菊 酯 ( bifenthrin ) 属 于 拟 除 虫 菊 酯 类 (pyrethroids) 仿生合成杀虫剂 ,由于其广谱 、高效 、低残 留和对人毒性较小等优点 ,被广泛用于农作物害虫和 家庭白蚁 、羊毛蛀虫防治等 ,因此接触人群较大 。曾有 研究发现氯菊酯 (permethrin) 具有抗雄激素作用[3] ,鉴
2 结果 211 Hershberger 试验 给药结束时 ,各组动物的终体 重与溶剂对照组比较 ,差异无统计学意义 ( P > 0105) 。 联苯菊酯低 、中 、高剂量组及氟他胺组 、睾酮缺乏组的 增重 与 溶 剂 对 照 组 比 较 , 分 别 减 少 110 %、1115 %、 1515 %、2314 %和 1512 % ,其中只有氟他胺组的增重减 少差异有统计学意义 ( P < 0105) 。睾酮缺乏组血清检 测不到睾酮 ,其余各组之间血清睾酮水平差异无统计 学意义 。与溶剂对照组比较 ,睾酮缺乏组 、氟他胺组肛 提肌加球海绵体肌总重量明显降低 ,以终体重为协变 量分析 ,除上述各组外 ,联苯菊酯高剂量组也有明显降 低 。睾酮缺乏组 、氟他胺组 、联苯菊酯高剂量组的精囊 腺和前列腺总重量 、尿道球腺 、阴茎头 、精囊腺和腹侧 前列腺重量明显降低 。因此 ,上述改变为联苯菊酯和 氟他胺抗雄激素作用的结果 (表 1) 。 212 报告基因试验 根据细胞生长抑制率 ,由“药物 抑制浓度计算软件”计算得出 IC50 为 11803 ×103μgΠml 。 DHT 能诱导荧光素酶基因表达 ,并呈现剂量2效应关系 (图 1) 。联苯菊酯在未引起明显细胞毒性的剂量下就 能抑制 DHT 依赖的 AR 活性 ,110 ×10 - 8 、110 ×10 - 7 、 110 ×10 - 6 、110 ×10 - 5 molΠL 组 的 抑 制 率 分 别 为 31174 %、35111 %、53172 、58116 , 呈 现 剂 量2效 应 关 系 (图 2) ,其通过作用 AR 而抑制荧光素酶报告基因表达 的 IC50 值为 01482μgΠml 。
联苯菊酯的抗雄激素作用及其机制
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【关键词】 环境抗雄激素 ;联苯菊酯 ; Hershberger 试验 ;报告基因试验
The antiandrogenic effect and mechanism of bifenthrin
ZHU Wei , ZHENG Yi2fan , ZHU Hui2juan , ZHU Xin2qiang ( Department of Toxicology , School of Public Health , Zhejiang University , Hangzhou Zhejiang 310031 ,China)
【 Key words】 Environmental antiandrogen ; Bifenthrin ; Hershberger assay ; Reporter gene assay
近十多年来 ,有关人类和野生动物暴露于环境内 分泌干扰物可能导致内分泌功能紊乱 、生殖和发育异 常等潜在危害一直受到人们的关注 ,目前至少已经发 现有上百种环境内分泌干扰物 ,其中主要是环境雌激
【Abstract】 Objective Herein we conducted in vivo and in vitro assays to investigate the antiandrogenic actitivity and mechanism of bifenthrin. Method Hershberger assay was used to determine the antiandrogenic potential of bifenthrin in vivo. Six2week2 old castrated male SD rats were randomly divided into six groups , each of which consisted of five rats. Each group of rats were administrated once daily for 7 days with testosterone propionate (TP) (100μg ,sc) ,excluding an additional group without TP ,plus gavage dosage of bifenthrin (115 ,415 and 1315 mgΠkg) ,flutamide (50 mgΠkg) ,while hormone deficient control and vehicle control groups of rats were gavaged with same volumes of corn oil. After 72day treatments ,all rats were euthanized and the liver ,kidney , spleen ,ventral prostate ,seminal vesicle were excised and weighed respectively. Transcriptional activation assay was used to determine the mechanism. Cells stably expressing an androgen2responsive reporter (AR) gene ,MDA2kb2 ,were treated with various concentrations of bifenthrin or known antiandrogen hydroxyflutamide with adding dihydrotestosterone (DHT) at the same time. Cells were lysed after incubation ,and then luciferase activity was measured. Finally the fold inductions over vehicle control were calculated as standard luciferase activity value , which represents antiandrogenic potency. Results In in vivo assay ,compared with vehicle control , bifenthrin at dose of 1315 mgΠkg caused significant decrease in some major androgen2responsive tissues ;while in in vitro assay ,it could block DHT2induced AR activity in MAD2 kb2 cells in a dose2dependent manner. Conclusion Bifenthrin is an environmental antiandrogen , and AR antagonism may contribute to its antiandrogenic activity ,which may occur before significant general toxicity presents.
·论著·
朱威 ,郑一凡 ,祝慧娟 ,朱心强 (浙江大学医学院预防医学系毒理学教研室 ,浙江 杭州 310031)
【摘要】 目的 探讨联苯菊酯的抗雄激素作用及其可能机制 。方法 体外雄激素受体 (AR) 依赖转录活化试验中 , 在 96 孔板上接种稳定表达荧光素酶报告基因的 MDA2kb2 细胞 ,加入联苯菊酯或已知抗雄激素 ,同时加一定剂量的双氢 睾酮 (DHT) 以诱导荧光素酶基因的表达 ,裂解细胞后测定荧光素酶活力值 ,以溶剂对照组的倍数比值作为标化荧光强度 单位 ,此值高低表示抗雄激素作用的大小 。体内 Hershberger 试验中 ,将去势的 30 只雄性大鼠随机分为联苯菊酯低 、中 、 高剂量 ,阳性对照 、溶剂对照和睾酮缺乏共 6 组 ,每组 5 只 。除睾酮缺乏组外每天皮下注射丙酸睾酮 (TP) 100μg ,连续7 d ; 给药组 、阳性对照组 、溶剂对照和睾酮缺乏组分别同时灌胃给予联苯菊酯 115 、415 和 1315 mgΠkg、氟他胺 50 mgΠkg、以及同 体积花生油 。7 d 后处死大鼠并称重雄激素依赖组织 。结果 Hershberger 试验中联苯菊酯 1315 mgΠkg 剂量组大鼠的精囊 腺 、腹侧前列腺等主要雄激素依赖组织重量与溶剂对照组比较 ,差异有统计学意义 ( P < 0105) ,但未出现明显的一般毒性 反应 。报告基因试验中 ,联苯菊酯 110 ×10 - 8 、110 ×10 - 7 、110 ×10 - 6 、110 ×10 - 5 molΠL 能拮抗 DHT 的荧光素酶诱导作用 ( P < 0105) ,呈剂量2效应关系 。结论 证实联苯菊酯是一种环境抗雄激素 ,其作用可发生在一般毒性之前 ,AR 拮抗可能 是其作用机制之一 。
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毒理学杂志 2006 年 10 月第 20 卷第 5 期 J Toxicol October 2006 Vol120 No15
于联苯菊酯与氯菊酯具有相似的化学结构及广泛的应 用 ,本实验通过体外和体内试验相结合的方法 ,研究其 是否具有抗雄激素作用及其可能的作用机制 。
1 材料与方法 111 试剂 Leibovitz’s L215 培养基 ( 美 国 Gibco 公 司) ,含 100 UΠml 青霉素钠 、100μgΠml 链霉素 、0125μgΠ ml 两性霉素 B ,胰蛋白酶 ,MTT(上海生工) ,羟基氟他 胺 (复旦大学药学院 ,纯度 > 99 %) ,丙酸睾酮 (上海通 用药业股份有限公司) ,双氢睾酮 (美国 Fluka 公司 ,编 号 :10300 ,纯度 > 99 %) ,荧光素酶测定试剂盒 (美国 Sigma 公司) ,氟他胺 (上海复旦复华药业有限公司) ,睾 酮测定放射免疫试剂盒 (天津德普公司) 。 112 细 胞 MDA2kb2 细 胞 ( 美 国 ATCC) , 培 养 在 37 ℃、无 CO2 细胞培养箱中 。 113 动物 清洁级 3 周龄 SD 雄性大鼠 30 只 ,体重 50 ～70 g ,由浙江省实验动物中心提供 ,合格证号 :20032 0001 。 114 雄激素受体报告基因试验 联苯菊酯的剂量为 110 ×10 - 8 、110 ×10 - 7 、110 ×10 - 6 、110 ×10 - 5 molΠL 。以 110 nmolΠL DHT 为 AR 激动剂对照 ,110 nmolΠL DHT + 1 μmolΠL OHF 为拮抗剂对照 ,1∶1 000的无水乙醇与 L215 培养液之混合液为相应的溶剂对照 ,每种处理各设 4 个平行样 。培养 24 h 后倒去受试液 ,用 PBS 轻轻洗涤 1 次 ,然后每孔加入 25μl 1 ×细胞裂解液 ,继续培养 15 min 以上直至细胞裂解完全。将荧光素酶测试缓冲液与 测试底物混合 ,平衡至室温 ,各孔依次加入 100μl 荧光 素酶测试液 ,测定荧光素酶活力值。 115 Hershberger 试验 将经去势的大鼠按体重随机 分为溶剂对照 ,睾酮缺乏 ,阳性对照 ,联苯菊酯高 、中 、 低剂量组共 6 组 ,每组 5 只 。除睾酮缺乏组 (只给予同 体积花生油) 外 , 每 只 动 物 每 天 皮 下 注 射 丙 酸 睾 酮 (TP ,100μg ,溶于 012 ml 花生油) ,连续 7 d 。实验组和 阳性对照组分别同时灌胃给予联苯菊酯 115 、315 、1315 mgΠ(kg·d) 和已知抗雄激素氟他胺 50 mgΠ( kg·d) ;溶剂
对照组和睾酮缺乏组同时灌胃给予同体积花生油 。每 天观察大鼠 2 次 ,一般情况 、中毒症状和死亡情况以及 食物利用等 。最后 1 次给药 24 h ,用戊巴比妥钠麻醉 后股动脉放血处死 ,收集血液并制备血清 , - 20 ℃保 存 ,采用放射免疫试剂盒测定血清睾酮水平 。取肝 、 脾 、肾 、肾上腺 、精液囊 (包括凝集腺及液体) 和前列腺 、 肛提肌加球海绵体肌 (LABC) 、尿道球腺 、阴茎头 、包皮 腺并称重 。 116 统计学方法 数据以 x ±s 表示 。采用单因素方 差分析 ,秩和法检验 。
作者简介 :朱威 ,在读硕士生 ,研究方向 :生殖毒理学 。 通讯作者 :朱心强 ,教授 ,医学博士 ,研究方向 :生殖毒理学 。
素和环境抗雄激素[1] 。在已确认或可疑的环境抗雄激 素中数量最多的是农药 ,包括杀虫剂 、杀菌剂和除草剂 等[2] 。联 苯 菊 酯 ( bifenthrin ) 属 于 拟 除 虫 菊 酯 类 (pyrethroids) 仿生合成杀虫剂 ,由于其广谱 、高效 、低残 留和对人毒性较小等优点 ,被广泛用于农作物害虫和 家庭白蚁 、羊毛蛀虫防治等 ,因此接触人群较大 。曾有 研究发现氯菊酯 (permethrin) 具有抗雄激素作用[3] ,鉴
2 结果 211 Hershberger 试验 给药结束时 ,各组动物的终体 重与溶剂对照组比较 ,差异无统计学意义 ( P > 0105) 。 联苯菊酯低 、中 、高剂量组及氟他胺组 、睾酮缺乏组的 增重 与 溶 剂 对 照 组 比 较 , 分 别 减 少 110 %、1115 %、 1515 %、2314 %和 1512 % ,其中只有氟他胺组的增重减 少差异有统计学意义 ( P < 0105) 。睾酮缺乏组血清检 测不到睾酮 ,其余各组之间血清睾酮水平差异无统计 学意义 。与溶剂对照组比较 ,睾酮缺乏组 、氟他胺组肛 提肌加球海绵体肌总重量明显降低 ,以终体重为协变 量分析 ,除上述各组外 ,联苯菊酯高剂量组也有明显降 低 。睾酮缺乏组 、氟他胺组 、联苯菊酯高剂量组的精囊 腺和前列腺总重量 、尿道球腺 、阴茎头 、精囊腺和腹侧 前列腺重量明显降低 。因此 ,上述改变为联苯菊酯和 氟他胺抗雄激素作用的结果 (表 1) 。 212 报告基因试验 根据细胞生长抑制率 ,由“药物 抑制浓度计算软件”计算得出 IC50 为 11803 ×103μgΠml 。 DHT 能诱导荧光素酶基因表达 ,并呈现剂量2效应关系 (图 1) 。联苯菊酯在未引起明显细胞毒性的剂量下就 能抑制 DHT 依赖的 AR 活性 ,110 ×10 - 8 、110 ×10 - 7 、 110 ×10 - 6 、110 ×10 - 5 molΠL 组 的 抑 制 率 分 别 为 31174 %、35111 %、53172 、58116 , 呈 现 剂 量2效 应 关 系 (图 2) ,其通过作用 AR 而抑制荧光素酶报告基因表达 的 IC50 值为 01482μgΠml 。