不育症患者精子DNA碎片化指数与精子常规参数关系的研究_孙超

第 31 卷第 4 期 2011 年 4 月
孙 超等：不育症患者精子 DNA 碎片化指数与精子常规参数关系的研究
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间接的检测主要采用吖啶橙等对精子染色后进行 观察， 其中吖啶橙染色结合流式细胞术的检测方 法即染 色质结构分 析法（SCSA）。 SCSA 由 Evenson 等 ［4］于 1980 年提出 ，经 过 20 多 年 的 发 展 已 成 为 成 熟的检查方法， 而吖啶橙结合荧光显微镜的检测 方法即吖 啶橙实验（AOT）由 Tejada 等［2］在 1984 年 提出。
常规参数 密度
DFI r －0．150
P 0．003
前向运动率
－0．089
0．085
总活动率
－0．114
0．028
正常形态率
－0．155
0．003
共同作用的 结果［3］。 精子 DNA 碎 片化 常 用 检 测 方 法分为间接和直接两种， 直接的检测方法有彗星 试验（COMET assay）、精子染色体扩散实验（SCD）、 末端转移酶介导的 dUTP 末端 标记法（TUNEL）等；
中位数 最小值 最大值 P25 P75
表 1 不育症患者精液分析结果
Tab 1 Semen parameters of infertility men
密度（106 个 ／ ml）
前 向 运 动 率 （％）
总 活 动 率 （％）
54．62 0．47 243．22 27．09 95．04
53．00 0
91．00 32．00 68．00
［Abstract］ Objective：Sperm DNA fragmentation has been assessed as a positive predictor of fertility potential in recent years． The aim of this study is using the acridine orange test （AOT） to analyze the relationship between sperm DNA fragmentation indexes（DFI） and semen conventional parameters of infertility men． Methods：Semen samples were collected from 376 infertility male patients in our andrology outpatient department．The samples were analyzed by improved Neubauer haemocytometer chamber and computer-aided sperm analysis（CASA） system to obtain concentration and motility parameters． All the samples were stained by Shorr staining method and the smears were analyzed according to Tygerberg strict criteria recommended by World Health Organization （WHO） to obtain morphology parameters． The DFI as marker of sperm DNA damage determined using the AOT． Results：Significant negative correlations were noted between DFI and sperm concentration（r＝－0．150，P＝0．003），motility（r＝－0．114，P＝0．028）and morphology（r＝－0．155， P＝0．003）． No significant correlations were found between DFI and sperm progressive motility （r＝－0．089，P＝0．085）． Conclusion：Sperm assessment for DNA status using AO is reliable and shows good correlation with sperm count，motility and morphology． Assessment of sperm DNA fragmentation with AOT measures a new parameter of male fertility． ［Key words］ sperm；chromatin；semen analysis；infertility；male
1 材料与方法
1．1 材料 376 份精液样本来源于在南京大学医学院附属
鼓楼医院男科实验室检查的男性不育症患者。 患者 年龄 21～47 岁，中位年龄 29 岁。 禁欲 2～7 天，手淫 留取精液，标本立即置入 37 ℃孵箱液化。
Carnoy’s 固定液： 甲醇和冰醋酸按 3∶1 比例配 制，每使用 5 次后更换；AO 工作液：10 g ／ L AO 原液 10 ml 加 0．1 mol ／ L 枸 橼 酸 40 ml 和 0．3 mol ／ L Na2HPO4 2．5 ml，pH2． 5。 10 g ／ L AO 原液避光、4 ℃ 储存。 1．2 方法 1．2．1 精子 AOT 检测
［摘 要］ 目的： 近年研究认为精子 DNA 碎片化是评价精子质量的重要指标， 本研究主要运用吖啶橙实验 （acridine orange
test，AOT）检测不育症患者精子 DNA 碎片化指数（DNA fragmentation index，DFI）与精子常规参数之间的关系。方法：收集本院男
科门诊 376 例不育症患者的精液标本，采用改良的 Neubauer 血细胞计数板人工分析精子密度，计算机辅助精液分析（CASA）分
［中图分类号］ R69ຫໍສະໝຸດ Baidu＋.2
［文献标识码］ A
［文章编号］ 1007-4368（2011）04-565-04
Research on the relationship between sperm DNA fragmentation and semen parameters of infertile men
［Acta Univ Med Nanjing， 2011， 31（4）: 565-567，570］
精液分析是男性不育症检查的基本项目，常 规检查主要包括精子密度、活力、活率和形态学， 然而这些数据不能全面评估精子质量和男性生育
［基金项目］ 国家自然科学基金（81070485） *通 讯 作 者 ，E-mail：ytdai＠hotmail．com
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南京医科大学学报
第 31 卷第 4 期 2011 年 4 月
检测精子 DNA 碎 片化指数（DNA fragmentation index，DFI），分 析 其 与 精 子 常 规 参 数 的 关 系 ，初 步 探 讨 DFI 在 评 估 男 性 精 子 质 量 中 的 应 用 价 值 ， 现 报 道如下。
分比值即精子 DFI。 1．2．2 精液分析
按 照 WHO 标 准 ［1］，在 射 精 后 30 min 至 1 h 内 完成对单个样本的密度和活率的分析。 精子密度采 用改良的 Neubauer 血细胞计数板人工分析。 精子活 力采用计算机辅助精液分析 （CASA） 系统 （伟 力 CASA 900）分析，观察 指标为精子 的前向运 动 率 和 总活动率；精子形态分析采用 Shorr 染色法，光学显 微镜下计数分析， 染色方法及评判标准参照 WHO 标准，计算精子正常形态率。 1．3 统计学分析
析精子活力。 精子形态分析采用 Shorr 染色法，分析标准采用 WHO 推荐的 Tygerberg 严格标准。 采用 AOT 检测精子 DNA 碎片
化程度。 结果：DFI 与精子密度呈负相关（r＝－0．150，P＝0．003）、与精子总活动率呈负相关（r＝－0．114，P＝0．028）、与精子前向运动率
采用 SPSS 17．0 统计软件。 由于精子各常规参 数均不服从正态分布， 各参数的均值和变异以中 位数（P25～P75）表示。 DFI 与 各指标之 间的相关性 采 用 Spearman 相 关 分 析 。 P ＜ 0．05 认 为 差 异 有 统 计 学意义。
2结果
2．1 精液分析结果 376 份精液分析的各项指标以中位数 （P25～P75）
SUN Chao，XU Zhi-peng，SHI Liang，DAI Yu-tian* （Department of Andrology，Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical College，Nanjing 210008，China）
表示，精子密 度为 54．62×106 个 ／ ml［（27．09～95．04）× 106 个 ／ ml］， 前 向 运 动 率 为 53．00％ （32．00％ ～68． 00％），总活动率为64．31％（42．12％～80．00％），正常形 态 率 为 9．30％ （4．00％ ～20．73％ ），DFI 为 28．00％ （16．50％～45．50％），具体见表 1。
第 31 卷第 4 期 2011 年 4 月
南京医科大学学报（自然科学版） ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING（Natural Science）
不育症患者精子 DNA 碎片化指数与精子常规参数关系的研究
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孙 超，徐志鹏，石 亮，戴玉田* （南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿男科，江苏 南京 210008）
能力。 随着生殖医学的发展，精子 DNA 的检测方法 逐渐成熟完善， 精子 DNA 碎片化的检测被认为是 一个新的评价精子质量和预测生育能力的指标 ［1］， 但 国 内 仍 未 将 精 子 DNA 碎 片 化 的 检 测 作 为 临 床 常规检查项目运用到男性不育症的诊疗中。 为此， 本 研 究 采 用 吖 啶 橙 实 验 （acridine orange test，AOT）
3讨论
精 子 DNA 碎 片 化 的 发 生 机 制 尚 不 完 全 清 楚 ， 一般认为与精子发生过程中精子染色质组装缺 陷、氧化应激或凋亡异常有关，也可能是几种机制
表 2 精子常规参数和 DFI 的关系
Tab 2 Correlations between sperm parameters and DFI
无统计学相关性（r＝－0．089，P＝0．085）、与精子正常形态率呈负相关（r＝－0．155，P＝0．003）。 结论：精子 DNA 碎片化指数与精子的密
度、总活动率及精子正常形态率具有负相关性，AOT 检测的 DFI 值为男性不育症的诊疗提供了一个新的指标。
［关键词］ 精子；染色质；精液分析；不育；男性
参照 Tejada 等［2］的方 法，取 液 化 后 的 新 鲜 精 液 用 0．1 mol ／ L PBS 洗 3 遍，离心，沉淀物再次混悬调 整精子数为 5×107 个 ／ ml，涂片，自然干燥；浸入固定 液 2 h， 自然干燥 。 新鲜 配 制 的 AO 工 作 液 浸 染 5 min，流水轻柔冲洗，蒸馏水封片后荧光显微镜（日本 Olympus BX51，×400）观察，每个 视野观察时 间 不 超 过 40 s。 计数 300 条精子中红色和黄色精子的总百
64．31 0
97．87 42．12 80．00
正 常 形 态 率 （％）
9．30 0
41．80 4．00
20．73
DFI（％）
28．00 1．00
95．00 16．50 45．50
2．2 DFI 与精子常规各参数的相关分析 DFI 与精子密度呈负相关 （r＝－0．150，P＝0．003），
与 精 子 总 活 动 率 呈 负 相 关 （r＝－0．114，P＝0．028）， 与 精 子 前 向 运 动 率 无 统 计 学 相 关 性 （r ＝－0．089，P ＝ 0．085），与 正 常 精 子 形 态 率 呈 负 相 关 （r＝－0．155，P＝ 0．003，表 2）。