植物基因工程
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农杆菌介导的转移方法 病毒为载体的转化方法
直接转移技术
基因枪法 花粉管通道法 原生质体法 PEG介导的转化法
2 农杆菌介导的转化方法
根癌农杆菌
根癌农杆菌是一种土壤微生物，在双子叶
植物中导致冠瘿病的形成。冠瘿瘤的形成 是由于Ti(tumor inducing) 质粒导致的。
2.1 根癌农杆菌
First field tests
Rotting resistant tomato approved by FDA
Delay-ripening tomato Commercialized in the US
GM maize approved by EU
1. 植物基因转移的主要方法
载体为媒介的转移方法
表达载体pBin19
2.3 发根农杆菌
发根农杆菌是另一种土壤农杆菌，含 有Ri质粒。Ri质粒和Ti质粒非常相似， 主要的区别在于Ri质粒的T-DNA转入 植物后并不导致冠瘿碱的形成，而是 形成毛发状的根。
2.4
病毒作为克隆载体
大部分的植物病毒的基因组是 RNA而不是DNA。 在植物上已知有两种DNA病毒
First Bt corn plants
Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized
‘83 ‘84 ‘85 ‘86 ‘87 ‘88 ‘89 ‘90 ‘91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ‘99 ‘00 ‘01 ‘02
转化率
转化率差异很大，一般在10-3~10-2
之间。
McCabe在大豆上高达2% 有的报道仅有10-4
3.1 基因枪转化法
影响因素
金属微粒 DNA沉淀辅助剂的影响 DNA的纯度及浓度对转化率的影响 微弹速度的影响 外植体的内在因素
3.1 基因枪转化法
基因枪转化法的缺点
成本高，转化率低
嵌合体比率大
遗传稳定性差
3.1 基因枪转化法
优点：
无宿主限制
受体类型广泛
可控度高
操作简便迅速
3.2 单子叶的植物基因转移
农杆菌一般只侵染双子叶植物不侵 染单子叶植物。 植株的再生受到基因型的限制。
3.2 单子叶的植物基因转移
直接基因转移可以部分解决着一问题。 标准的方法利用原生质体，再生的困 难仍然存在。 基因枪转化提供了解决方法，直接将 质粒DNA打到胚胎上。
双元载体系统是将T-DNA连在一个
小质粒上，Ti质粒的其他的部分以 正常的状态存在。
2.2 转化
共整合策略(cointegrative system)
利用以pBR322或相似的大肠杆菌载
体，但含有一小部分T-DNA。基因 可以插入小的质粒的单一酶切位点 上。
2.2 转化
只有利用“卸甲”的Ti质粒才能 获得转基因植株，而不形成冠瘿 瘤。 使用的载体必须是表达载体。
从1983年第一例转基因植物 （烟草）问世，到1993年，世界上 转基因成功的植物就已突破60种； 从1986年首批转基因作物获准进行 田间实验，到1993年获准进行田间 实验的转基因植物已达1025例，涉 及38种植物。这十年是植物转基因 的研究走向应用的重要准备阶段。
First transgenic plant
2.2 转化
利用Ti质粒将目的基因引入植物 将基因插入T-DNA中，细菌就可以 将它整合到植物的染色体DNA中。 问题： Ti质粒分子太大。 200kb的分子中无法找到单一切点 的酶。
2.2 转化
双元载体策略 共整合策略
2.2 转化
双元载体策略(binary vector system)
3 直接基因转移
原理：
可以重组整合到植物染色体内。
1984年发现，超螺旋结构的细菌质粒，
3 直接基因转移
代表性的方法是基因枪法
火药爆炸力 高压气体
氦气 氢气 氮气
高压放电
A
B
1 2 3 4 5
基因枪转化原理 基因枪转化前(A)及转化后(B)的主要部分示意图
3.1 基因枪转化法
农杆菌有四种类型： 章鱼碱（octopine） 胭脂碱（nopaline） 农杆碱（agropine） 琥珀碱（succinamopine）
2.1 根癌农杆菌
Ti 质粒分为4个区
T-DNA区 Vir区（Virulence region) Con区（region encoding conjugation) Ori区（origin of replication)
花粉管通道法
转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现
4 受体材料的选择
（1）良好的植物基因转化系统应具有的条件：
高效稳定的再生能力； 受体材料要有较高的遗传能力；
具有稳定的外植体来源；
对筛选剂敏感。
（2）常用受体材料的类型：
愈伤组织再生系统
直接分化再生系统 原生质体再生系统
植物基因工程
Part I 植物基因工程概论
Cultivation and others 20%
Water, fertilizer, and farm chemicals 42%
Variety 38%
The contributions of different methods in raising crop out-put (FAO, 1998).
花椰菜花叶病毒 二价病毒（geminivirus）
2.4
病毒作为克隆载体
花椰菜花叶病毒载体:
装载能力有限。 寄主范围窄，主要是芸苔属植物如
芜菁、甘蓝和花椰菜等。
2.4 病毒作为克隆载体
二价病毒
自然中他侵染重要的作物，如玉米和
小麦。 在侵染过程中，二价病毒重新排列并 删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。 安全性。
胚状体再生系统
生殖细胞再生系统
Part II 基因工程策略
基因工程策略：
基因附加：通过添加1个或多个
基因改变植物的性状。 基因扣除：利用基因工程技术使 一个或多个植物已经存在的基因 失活。
反义技术 定点突变
1 基因附加百度文库
抗虫转基因植物的培育
1.1 Bt蛋白
苏云金杆菌的δ-内毒素
直接转移技术
基因枪法 花粉管通道法 原生质体法 PEG介导的转化法
2 农杆菌介导的转化方法
根癌农杆菌
根癌农杆菌是一种土壤微生物，在双子叶
植物中导致冠瘿病的形成。冠瘿瘤的形成 是由于Ti(tumor inducing) 质粒导致的。
2.1 根癌农杆菌
First field tests
Rotting resistant tomato approved by FDA
Delay-ripening tomato Commercialized in the US
GM maize approved by EU
1. 植物基因转移的主要方法
载体为媒介的转移方法
表达载体pBin19
2.3 发根农杆菌
发根农杆菌是另一种土壤农杆菌，含 有Ri质粒。Ri质粒和Ti质粒非常相似， 主要的区别在于Ri质粒的T-DNA转入 植物后并不导致冠瘿碱的形成，而是 形成毛发状的根。
2.4
病毒作为克隆载体
大部分的植物病毒的基因组是 RNA而不是DNA。 在植物上已知有两种DNA病毒
First Bt corn plants
Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized
‘83 ‘84 ‘85 ‘86 ‘87 ‘88 ‘89 ‘90 ‘91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ‘99 ‘00 ‘01 ‘02
转化率
转化率差异很大，一般在10-3~10-2
之间。
McCabe在大豆上高达2% 有的报道仅有10-4
3.1 基因枪转化法
影响因素
金属微粒 DNA沉淀辅助剂的影响 DNA的纯度及浓度对转化率的影响 微弹速度的影响 外植体的内在因素
3.1 基因枪转化法
基因枪转化法的缺点
成本高，转化率低
嵌合体比率大
遗传稳定性差
3.1 基因枪转化法
优点：
无宿主限制
受体类型广泛
可控度高
操作简便迅速
3.2 单子叶的植物基因转移
农杆菌一般只侵染双子叶植物不侵 染单子叶植物。 植株的再生受到基因型的限制。
3.2 单子叶的植物基因转移
直接基因转移可以部分解决着一问题。 标准的方法利用原生质体，再生的困 难仍然存在。 基因枪转化提供了解决方法，直接将 质粒DNA打到胚胎上。
双元载体系统是将T-DNA连在一个
小质粒上，Ti质粒的其他的部分以 正常的状态存在。
2.2 转化
共整合策略(cointegrative system)
利用以pBR322或相似的大肠杆菌载
体，但含有一小部分T-DNA。基因 可以插入小的质粒的单一酶切位点 上。
2.2 转化
只有利用“卸甲”的Ti质粒才能 获得转基因植株，而不形成冠瘿 瘤。 使用的载体必须是表达载体。
从1983年第一例转基因植物 （烟草）问世，到1993年，世界上 转基因成功的植物就已突破60种； 从1986年首批转基因作物获准进行 田间实验，到1993年获准进行田间 实验的转基因植物已达1025例，涉 及38种植物。这十年是植物转基因 的研究走向应用的重要准备阶段。
First transgenic plant
2.2 转化
利用Ti质粒将目的基因引入植物 将基因插入T-DNA中，细菌就可以 将它整合到植物的染色体DNA中。 问题： Ti质粒分子太大。 200kb的分子中无法找到单一切点 的酶。
2.2 转化
双元载体策略 共整合策略
2.2 转化
双元载体策略(binary vector system)
3 直接基因转移
原理：
可以重组整合到植物染色体内。
1984年发现，超螺旋结构的细菌质粒，
3 直接基因转移
代表性的方法是基因枪法
火药爆炸力 高压气体
氦气 氢气 氮气
高压放电
A
B
1 2 3 4 5
基因枪转化原理 基因枪转化前(A)及转化后(B)的主要部分示意图
3.1 基因枪转化法
农杆菌有四种类型： 章鱼碱（octopine） 胭脂碱（nopaline） 农杆碱（agropine） 琥珀碱（succinamopine）
2.1 根癌农杆菌
Ti 质粒分为4个区
T-DNA区 Vir区（Virulence region) Con区（region encoding conjugation) Ori区（origin of replication)
花粉管通道法
转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现
4 受体材料的选择
（1）良好的植物基因转化系统应具有的条件：
高效稳定的再生能力； 受体材料要有较高的遗传能力；
具有稳定的外植体来源；
对筛选剂敏感。
（2）常用受体材料的类型：
愈伤组织再生系统
直接分化再生系统 原生质体再生系统
植物基因工程
Part I 植物基因工程概论
Cultivation and others 20%
Water, fertilizer, and farm chemicals 42%
Variety 38%
The contributions of different methods in raising crop out-put (FAO, 1998).
花椰菜花叶病毒 二价病毒（geminivirus）
2.4
病毒作为克隆载体
花椰菜花叶病毒载体:
装载能力有限。 寄主范围窄，主要是芸苔属植物如
芜菁、甘蓝和花椰菜等。
2.4 病毒作为克隆载体
二价病毒
自然中他侵染重要的作物，如玉米和
小麦。 在侵染过程中，二价病毒重新排列并 删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。 安全性。
胚状体再生系统
生殖细胞再生系统
Part II 基因工程策略
基因工程策略：
基因附加：通过添加1个或多个
基因改变植物的性状。 基因扣除：利用基因工程技术使 一个或多个植物已经存在的基因 失活。
反义技术 定点突变
1 基因附加百度文库
抗虫转基因植物的培育
1.1 Bt蛋白
苏云金杆菌的δ-内毒素