微生物总数检测方法(芽孢杆菌)

微生物总数检测方法（芽孢杆菌）

一、检测用培养基配方与培养条件

1.培养基：营养琼脂

配方：以北京路桥营养琼脂为例，按说明上配制需营养琼脂3.3克，水100毫升。（尽量避免使用牛肉膏蛋白胨培养基）

2. 培养条件：温度：33℃-37℃；时间：18--24小时。

二、检测与计数方法

1. 梯度稀释

取250ml锥形瓶一个，加入适量玻璃珠，100ml无菌水，3滴吐温80（分散剂：分散菌团用），塞上胶塞并放入到70℃水浴锅中预热，待锥形瓶中水温达到70℃后，称取适量样品加入锥形瓶中，摇匀，70℃水浴20分钟。水浴结束后迅速冷却到30—40℃左右，上旋转式摇床200 r/min充分振荡40 min，即成母液菌悬液（基础液）。

2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行梯度稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。

3. 加样及培养

取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1ml (菌悬液加入量)，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。

4. 菌落识别

根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。

5. 菌落计数

以出现20—300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。有效菌平均菌落数（x）在20—300之间时，则以该菌落数计算。

有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：

nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1）

式中：

nm —质量有效活菌数，亿/g

nv —体积有效活菌数，亿/mL

x—有效菌落平均数，个

k —稀释倍数

v1—基础液体积， mL

v2—菌悬液加入量， mL

v0—样品量，mL

m0—样品量， g

重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。所以：

①悬液中要加分散剂分散菌团；

②水浴热处理一方面杀死营养体，另一方面加快分子热运动进一步分散菌团；

③震荡时间也要较液态发酵产品时间长，使用旋转式摇床控制在180——

200r/min 。（往复式摇床的震荡处理一样，若有菌悬液溅起，可用保鲜膜事先将棉塞包裹一下，以便溅起的部分液滴迅速流回悬液中。）

④水浴后迅速冷却。先水浴，后震荡。

注：杂菌判断需注意以下几点：

1、因有的菌先长出来，有的菌后长出来，表现在平皿上的菌落形态可能有一定差别，可

能判断为杂菌。

2、因平皿的营养条件很丰富，不可能形成芽孢，镜检结果应是杆菌，而不是芽孢，可能

判断为杂菌。