第三节重组子的筛选与鉴定-西安电子科技大学个人主页系统.ppt
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只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交， 在底片上曝光显示。
三、核酸分子杂交检测法
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 1.
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 2 用（或）探针检测样品。
主要检测插入片断是 否被转录。
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法
3. 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
从转化后的 菌体克隆中分离 质粒，电泳、比 较其分子量。
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法 1. 原理 根据已知的外源序列的限制性酶切图谱，
选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法
A或B
二、物理检测法
A
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 待测基因
125I标记的二抗
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法
2. 放射性抗体检测法过程
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 3. 双位点检测法
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
节重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法 二、物理检测法
第三节 重组子的筛选与鉴定
相关概念 转化子
导入外源基因分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子
含有重组分子的转化子； 筛选和选择
经过各种方法将外源分子导入受体细胞后，获得所需的阳性重组子的过程； 筛选
通过某种特定的方法，如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体或基因文 库中鉴定出阳性重组子的过程； 选择
质粒基因A
插入基因B
重组质粒
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 3. 双位点检测法
固相支 持滤膜
抗A抗体
质粒蛋白A
外源蛋白B
固相支
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
125I标记的 抗B抗体
四、免疫化学检测法
(二)免疫沉淀检测法 检测分泌型产物。
乳糖
半乳糖
+ 葡萄糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
+ 5-溴-4-氯靛蓝
（1）原理
深蓝色
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 322 选择过程 （1）四环素抗性插入失活
如果在上插入外源，导致四环素抗性基因失活，可 用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死， 保留下来；
不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨 酸杀死。
1.原理 （1）弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的
表型。 例：小鼠的转二化受轻叶酸还三 平原甲板酶氧苄（二氨）嘧对啶培三养基
二、物理检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量 比野生型载体分子量大。 (一)凝胶电泳检测法
通过某种外加因素的辨别作用，呈现具有重组分子的特定克隆的方法
一、遗传学检测法
该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受 体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表 型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。
优点：简便、快速，结果较可靠。 缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的 突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果上插入外源，导致氨苄青霉素抗 性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法
2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、核酸分子杂交检测法
(一)原理
1. 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针 与外源插入片断互补的序列。
3. 识别标记
32P 或 125I 。
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 1.
用（或）探针检测样品。从宿主细胞中提取 （或质粒载体），再用探针杂交。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活 选择法
如：322质粒上有两个 抗菌素抗性基因: 和。 上有插入位点 I和 I; 上有插入位点 I。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 322抗菌素标记选择 （1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因：产生 -内酰胺酶， 使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停
①（）
① :是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性 状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
(二)核酸杂交检测方法
3.
电泳
(二)核酸杂交检测方法
胶
膜
3.
② 转膜
蛋白
③ 杂交 硝酸纤 待测蛋白 一抗 二抗 维素膜
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 4.原位杂交
特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找 出阳性菌落。
四、免疫化学检测法
利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产 物。蛋白—蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 (一)放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为以下几种作用方式：
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式
三、核酸分子杂交检测法
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 1.
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 2 用（或）探针检测样品。
主要检测插入片断是 否被转录。
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法
3. 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
从转化后的 菌体克隆中分离 质粒，电泳、比 较其分子量。
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法 1. 原理 根据已知的外源序列的限制性酶切图谱，
选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法
A或B
二、物理检测法
A
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 待测基因
125I标记的二抗
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法
2. 放射性抗体检测法过程
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 3. 双位点检测法
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
节重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法 二、物理检测法
第三节 重组子的筛选与鉴定
相关概念 转化子
导入外源基因分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子
含有重组分子的转化子； 筛选和选择
经过各种方法将外源分子导入受体细胞后，获得所需的阳性重组子的过程； 筛选
通过某种特定的方法，如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体或基因文 库中鉴定出阳性重组子的过程； 选择
质粒基因A
插入基因B
重组质粒
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 3. 双位点检测法
固相支 持滤膜
抗A抗体
质粒蛋白A
外源蛋白B
固相支
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
125I标记的 抗B抗体
四、免疫化学检测法
(二)免疫沉淀检测法 检测分泌型产物。
乳糖
半乳糖
+ 葡萄糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
+ 5-溴-4-氯靛蓝
（1）原理
深蓝色
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 322 选择过程 （1）四环素抗性插入失活
如果在上插入外源，导致四环素抗性基因失活，可 用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死， 保留下来；
不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨 酸杀死。
1.原理 （1）弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的
表型。 例：小鼠的转二化受轻叶酸还三 平原甲板酶氧苄（二氨）嘧对啶培三养基
二、物理检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量 比野生型载体分子量大。 (一)凝胶电泳检测法
通过某种外加因素的辨别作用，呈现具有重组分子的特定克隆的方法
一、遗传学检测法
该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受 体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表 型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。
优点：简便、快速，结果较可靠。 缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的 突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果上插入外源，导致氨苄青霉素抗 性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法
2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、核酸分子杂交检测法
(一)原理
1. 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针 与外源插入片断互补的序列。
3. 识别标记
32P 或 125I 。
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 1.
用（或）探针检测样品。从宿主细胞中提取 （或质粒载体），再用探针杂交。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活 选择法
如：322质粒上有两个 抗菌素抗性基因: 和。 上有插入位点 I和 I; 上有插入位点 I。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 322抗菌素标记选择 （1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因：产生 -内酰胺酶， 使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停
①（）
① :是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性 状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
(二)核酸杂交检测方法
3.
电泳
(二)核酸杂交检测方法
胶
膜
3.
② 转膜
蛋白
③ 杂交 硝酸纤 待测蛋白 一抗 二抗 维素膜
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 4.原位杂交
特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找 出阳性菌落。
四、免疫化学检测法
利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产 物。蛋白—蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 (一)放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为以下几种作用方式：
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式