【CN110055169A】一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统【专利】
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910376237.2
(22)申请日 2019.05.07
(71)申请人 电子科技大学
地址 611731 四川省成都市高新区（西区）
西源大道2006号
(72)发明人 汤丽霞 伊嘉格尔 陈勇 邓娇
方瑞琴
(74)专利代理机构 成都点睛专利代理事务所
(普通合伙) 51232
代理人 葛启函
(51)Int.Cl.
C12M 1/34(2006.01)
C12M 1/00(2006.01)
C12Q 1/34(2006.01)
C40B 30/08(2006.01)
(54)发明名称
一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关
微流体系统
(57)摘要
一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关
微流体系统，属于酶工程技术领域。
本发明利用
卤醇脱卤酶催化底物释放质子造成pH降低，pH降
低可通过指示剂颜色改变来反映，在比色原理的
基础上搭建集成图像采集和图像分析设备的微
流体系统。
所述文库定量筛选的方法基于纸质微
流体平台，在固定有指示剂的微流体载体上吸附
卤醇脱卤酶，滴加底物后进行孵育，通过指示剂
检测pH值变化，发生颜色变化后进行图像采集，
通过图像分析获取质子浓度和指示剂颜色强度
的线性关系作为标准曲线，基于所述标准曲线检
测吸附卤醇脱卤酶突变体的微流体反应体系中
质子浓度，通过微流体反应体系中质子浓度实现
酶活性的测定。
本发明具有简单、快速、灵敏的特
点，
实现了卤醇脱卤酶文库的定量筛选。
权利要求书2页 说明书7页 附图8页CN 110055169 A 2019.07.26
C N 110055169
A
权 利 要 求 书1/2页CN 110055169 A
1.一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，包括微流体平台、图像采集设备以及后端图像分析设备；所述微流体平台包括吸附有pH指示剂和缓冲液的载体，所述微流体平台用于反映文库中酶蛋白突变体催化底物导致微环境pH变化所引起的颜色变化，所述图像采集设备用于采集微流体平台的颜色图片，所述图像分析设备用于分析所述颜色图片的颜色强度并基于质子浓度与颜色强度间的标准曲线计算酶活。
2.根据权利要求1所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述酶蛋白突变体为卤醇脱卤酶突变体，所述pH指示剂为苯酚红指示剂，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述标准曲线为0～1.2mM范围内质子浓度与pH指示剂最终颜色强度之间的线性关系。
4.根据权利要求1所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述载体具体为玻璃纤维或纤维素纸。
5.一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：构建微流体平台；
在载体上吸附苯酚红指示剂和HEPES缓冲液；
步骤B：建立标准曲线；
在0～1.2mM范围内选择多个已知浓度的HCl溶液，将已知浓度的HCl溶液滴加到吸附有HEPES缓冲液的载体上，然后滴加苯酚红溶液进行反应，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，不同浓度的HCl溶液重复上述步骤，得到不同浓度HCl 溶液下载体的颜色图片；通过对不同浓度HCl溶液下载体的颜色强度进行分析，建立得到颜色强度与质子浓度的线性关系作为标准曲线；
步骤C：文库定量筛选；
将文库中卤醇脱卤酶突变体吸附在经步骤A处理得到的载体上，然后加入卤醇脱卤酶的底物进行孵育，待孵育完成，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，分析图像中颜色强度并根据步骤B得到标准曲线得到质子浓度，再通过质子浓度测定酶的活性。
6.根据权利要求5所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述步骤A 中载体具体优选为玻璃纤维或纤维素纸。
7.根据权利要求5所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述步骤A 中HEPES缓冲液的浓度范围为0.5～2mM。
8.根据权利要求5所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述步骤C 中卤醇脱卤酶突变体为无细胞酶提取物或者全细胞酶提取物。
9.根据权利要求8所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述全细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂进行温育，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中，得到用于文库筛选的全细胞酶提取物；所述无细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂，于37℃温育18小时，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中进行超声裂解，离心细胞裂解物，得到上清液作为用于文库筛选的无细胞酶提取物。
2。