表观遗传学研究方法

18
8
主要内容 表观遗传学的研究方法来自 组蛋白的修饰和相关的酶 - 体内蛋白-DNA的相互作用ChIP技术 转录后的表观遗传调控 - 体内蛋白-RNA的相互作用RIP技术 - SmartFlare 灵光技术 DNA甲基化 端粒酶
19
核小体与组蛋白
•富含带正电荷的碱性氨基酸 (Arg和Lys), 能够同DNA中带 负电荷的磷酸基团相互作用。 •组蛋白是已知蛋白质中最保 守的。
6
抑制剂与激酶 分析试剂盒 抗体 仪器 耗材 细胞系
细胞培养基和培养板
3
默克密理博 旗下品牌…
明星产品线： • • • • • 小分子抑制剂 癌症研究
原核表达（PET） 昆虫表达 蛋白抽提和纯化
Merck Millipore is a division of
7
默克密理博 旗下品牌…
明星产品线： • 表观遗传学 • 药物研发，药物筛选 • 干细胞 • 神经
Central Dogma
DNA
RNA
Protein
Typical Example of Epigenetics Regulation
6
为什么你的DNA不 能决定你的命运？
——《时代》杂志 2010年1月封面
14
什么是表观遗传学 ?
DNA
RNA
Protein
表观遗传学调控：

影响基因转录活性
组蛋白的甲基化修饰 (Methylation)
24
11
细胞内组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶的活性
Wu et al., PNAS 2007
Harrod et al. JBC 2003 Ito et al. The New England J. of Med. 2005
• 几十种乙酰化组蛋白, HATs和HDACs的抗体 • 试剂盒：HAT Assay Kit (17-289), p300/CBP Immunoprecipitation HAT Assay Kit (17-284), HDAC Assay Kit • SIRTainty Class III HDAC Assay (17-10090)
化学发光 胞内检测 无需裂解细胞 高通量96孔板 胞内检测：避免裂解后的去磷酸化和蛋白降解
36
15
H2B Serine 14 Phosphorylation Apoptosis marker 凋亡进展不可逆的重要标志
Left: anti-phospho histone H2B (Ser14) (07-191) Right: DAPI
38
Asynchronous HeLa cells stained with antiphospho H3 (Ser10 ) (cat. #06-570) in red and anti-beta tubulin (cat. #05-661) in green. Serine 10 phosphorylation of H3 is almost exclusively observed on condensing mitotic chromosomes (arrows).
Epigenetics
表观遗传学的研究方法
钟丹丹，Ph.D Senior Field Application Scientist dan.dan.zhong@ Merck Millipore
1
Millipore
Millex 滤器 Amicon Ultra 超滤管
Immobilon 转印膜
26
12
HDAC Assays
-HDAC Colorimetric #17-374 (nonradioactive) -HDAC Fluorometric #17-372/17-356 (non-radioactive) -HDAC Assay Kit #17-320 (radioactive kit)
H1 H2A H2B H3 H4
20
9
组蛋白
• 五种类型：H1 、H2A 、H2B 、H3 、H4, 保守, 102-135氨基酸组成 • 是一类小分子碱性蛋白质富含带正电荷的碱性氨基酸（Arg和Lys), 能够同 DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用 • H2A，H2B，H3和H4各2个分子构成的8聚体是核小体的核心部分 • H1的作用是与线形 DNA结合以帮助后者形成高级结构。
H2A
P
SGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQ 1
P H2B
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKK 14
P PP P
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 3 1011 28
P P H4
H3
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRVLRDNIQGIT 1 18
2
1
默克集团公司简介
世界上历史最悠久的医药化工企业，其历史可追溯到1668年
目前分为医药和化工两大业务板块
在64个国家拥有分支机构，员工近40000人 年销售额超过74亿欧元 此默克非彼默克（默沙东） 2010年收购Millipore 2011年收购清大天一
www.history.merck.de
DNA
Histones
21
Chromatin
组蛋白共价修饰
N- and C- 末端会被翻译后修饰 N末端伸出聚体表面，是修饰的主要所在
组蛋白共价修饰类型:
22
10
组蛋白的乙酰化修饰 (Acetylation)
Ac Ac 9 H2A
P300 PCAF
SGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQ
25
HAT Assays
HAT Assay Kit Indirect ELISA 化学发光 检测 安全：非放射性 定量检测 包含阳性对照：H3 and H4 biotinylated peptides (mod/unmod) 包含全部试剂：Acetyl CoA, Anti-acetyl Lysine, secondary HRP, TMB #17-289
Phosphorylation of H3 ( Ser10) cell mitosis marker
Detection of H2B phosphorylated at serine 14 in HL-60 cells stimulated to undergo apoptosis by treatment with VP-16. Left: anti-phospho histone H2B (Ser14) (07-191) staining. Right: DAPI staining. Courtesy Dr. David Allis, The Rockefeller University
1 P
主要功能
H2B
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKK
14 P PP P H3
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
3 1011 28 P P
H4
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRVLRDNIQGIT
1 18
•抑制基因转录 •细胞凋亡相关 • DNA损伤修复相关 •参与细胞周期和 减数分裂 •细胞分裂相关
• Histone aceytltransferase (HAT) • Histone deacetylase (HDAC) • 可逆的动态过程 • 乙酰化激活特定基因的转录过程，去乙酰化抑制转录。
23
HATs、HDACs与肿瘤, HDAC inhibitors与肿瘤治疗
o Many tumor suppressor genes are silenced by a mechanism involving DNA methylation and histone deacetylation, contributing to many types of cancer. HDAC inhibitors currently show tremendous early promise as treatment agents.
5 Ac 5 Ac 12 Ac 15 Ac 20 H2B
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKK
Ac 9 Ac 14 Ac 18 Ac 23 Ac 27 H3
ARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
Ac 5 Ac 8 Ac 12 Ac 16 H4
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRVLRDNIQGIT
Merck & Millipore: A Perfect Fit…
2
Millipore becomes the Life Science Division of Merck in the Chemicals Sector
Merck KGaA
Chemicals
(Business Sector)
Pharmaceuticals
o The 1st drug of this type, suberoylanilide hydroxamic acid (Verinostat,伏立诺他,MSD) was approved by the FDA for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma in 2006.
32
组蛋白磷酸化(Histone phosphorylation)
组蛋白 H2A H2B H3 H4 修饰位点 S1 S14 S33 S10 T3 S10 T11 S28 S1 主要功能 抑制基因转录，参与细胞周期和减数分裂 细胞凋亡和DNA损伤修复 细胞周期的演进和发育 细胞分裂 细胞分裂中染色体排列等 细胞分裂，细胞凋亡 细胞分裂 细胞分裂，细胞凋亡 DNA损伤修复，参与细胞周期和减数分裂
33
14
Histone H2A.X Phosphorylation Ser139 DNA 损伤和凋亡的重要生物学标记
Good marker for early apoptosis Sensitive readout for DNA damage 凋亡早期判断的重要标志
*H2A.X 是H2A的变异体:unique C-term. *是DNA断裂的感应器,参与DNA修复 *H2A.X缺陷参与肿瘤发生 *DNA DSB( double-strand breakage)导致其特 异位点磷酸化的发生
不涉及DNA序列改变的
可遗传的基因表达的调控
15
7
怎样研究表观遗传学？
17
主要内容 表观遗传学的研究方法
染色质、组蛋白的修饰和相关的酶 - 体内蛋白-DNA的相互作用ChIP技术 转录后的表观遗传调控 - 体内蛋白-RNA的相互作用RIP技术 - SmartFlare 灵光技术 DNA甲基化及MSP 端粒的作用及端粒酶检测的方法
HDAC 分析试剂盒 (17-374) •显色检测 •96孔板格式 •安全：非放射性 •简易：两步法试验定量检测
27
SIRTainty Class III HDAC ASSAY
灵敏度大5倍！
13
组蛋白磷酸化修饰
P
(Phosphorylation)
H2A
SGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQ
H2A.X Phosphorylation assay (Cat# 17-327) Cell-based ELISA （CELISA） Log phase NIH3T3/A31 cells were treated for 2 hours with increasing Etoposide
34
H2A.X Phosphorylation Assay Kit （17-327）
• 代谢类疾病 • （ELISA & Milliplex） • 凋亡 •
8
4
Merck Millipore & Upstate
, now a part of Merck Millipore
Epigenetics vs Genetics？
5
Classical genetics
(Business Sector)
Performance Materials
(Division)
Merck Millipore
(Division)
Merck Serono
(Division)
Consumer Health Care
(Division)
今天的默克密理博：生命科学全套解决方案
细胞信号转导 药物研发 癌症研究 干细胞 神经科学 表观遗传学 蛋白质研究