(生物科技行业类)食品微生物学实验综合性实验细菌生长条件的探讨

实验一、大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定

（综合性实验）

(一)目的

1.通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本实验技能。

2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。

3.学习用比浊法测定细菌的生长曲线。

4.比较不同培养基的生长曲线

(二)原理

将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期。这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。

(三)材料

1. 菌种：

大肠杆菌（Escherichia coli）

2. 营养琼脂培养基：根据产品说明配制

3. 生理盐水（0.9%NaCl）100mL，分装入10支试管（每支9mL）

4．培养基：本实验采取正交实验确定大肠杆菌最优的生长条件，采取L934正交表，正交设计如下：

表头（L934）：

实验设计：

培养基经121℃灭菌20min。

5 仪器及其他用品

721型分光光度计、比色杯、恒温摇床、培养箱、高压灭菌器、电子天平、pH计、酒精灯、电炉、接种环、试管架、培养皿10个、无菌吸管（1mL）10支、烧杯、试管、锥形瓶12个（250mL）、胶头、牛皮纸、硅胶塞等。

(四)流程

种子液标记接种培养测定

(五)步骤

1.标记编号

按要求配制培养基，将无菌培养基装于10个250ml锥形瓶，分别编号为0h，4h，6h，

8h，11h，14h，16h，18h，19h，21h。

2.接种培养

(1)种子液制备：

取大肠杆菌（Escherichia coli）斜面菌种一支，用接种环刮取少量细菌于生理盐水（或无菌水）中，用胶头滴管震荡均匀。

(2)摇床培养：

用1mL无菌吸管分别准确吸取1mL种子液加入已编号的9个三角瓶中，于37℃下在恒温摇床上培养（180r.min-1）（以上步骤均需在无菌操作台上操作）。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中（2-4℃）贮存，待培养结束时一同测定OD值。

3.生长量的测定

将未接种的培养基倒入比色杯中，选用640nm分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.1-0.65之间，经稀释后测得的OD值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

4.对第16h的培养液进行倒平板。

(六)生长曲线的比较

对所得数据进行生长曲线的绘制，比较各组培养基生长曲线上最大吸光度，

(七)思考题

1.刚买来的菌种一般是冻干菌，应如何接种到斜面？

2.在培养基调pH时应选用什么试剂？

3.在接种培养时，对应时间取出三角瓶后，为什么要立即放到冰箱中贮存？

4.正交试验设计中，应如何进行数据处理分析？正交试验是如何确定最佳生长条件？

实验七多聚磷酸盐与大豆蛋白的保水性研究（一）实验目的

1.了解提高保水率的原理和方法。

2.掌握多聚磷酸盐和大豆蛋白提高保水率的机理。

3.掌握正交实验的方法。

（二）实验原理

1. 磷酸盐对肉制品保水性的影响

磷酸盐肉制品中应用的磷酸盐结构基本相似,是由一个或多个磷酸盐单元连接成的，常用的几种磷酸盐有三聚磷酸盐，焦磷酸盐，六偏磷酸盐，正磷酸盐等。除了焦磷酸盐外,其他的磷酸盐都是中性或中性偏碱的，磷酸三钠不能在肉制品中应用,磷酸钾价格较高且易吸潮,也较少使用。磷酸盐的加入一般是先配制成溶液,根据不同需要采取直接加入或注射加入,其最大添加量为0.5% 。不同磷酸盐改善制品的效果不同,其改善效果为:焦磷酸盐>三聚磷酸盐>六偏磷酸盐=正磷酸盐,磷酸盐的效果普遍优于其他盐类,但两者并用时,效果具有协同性，磷酸盐可以改善肉制品的功能特性。减少颜色风味的败坏，它改善肉制品功能特性的机制和其他盐类相似,从肉中提取肌原纤维蛋白,加热时蛋白质相互作用,形成一个强而有序的三维立体网状热固定结构,这种纤维蛋白晶格结构把小肉块粘结在一起,中间的缝隙束缚水分,从而提高了肉制品的保水性。许多学者认为磷酸盐作用效果好于其他盐类是因为磷酸盐能提高肉制品的pH值,促进肌原纤维蛋白的提取,增强了热固定结构的强度，焦磷酸盐能离解肌动球蛋白(一种主要的肌原纤维蛋白),增加了肌原纤维蛋白的提取。另外,磷酸盐还能延长肉制品的货架期,主要是因为磷酸盐能减少色素和脂类的氧化,研究人员认为磷酸盐能螯合自由离子(一种氧化强化剂),这样就降低了肌球蛋白的氧化,从而减少颜色和风味的败坏。虽然磷酸盐是一种很有用的添加剂,但添加量不应超过0.5%,磷酸钠处理的肉有甜味，偏磷酸钠处理的肉有涩味等，且当其用量大于0.3%时,就会有金属味。而且经常使用磷酸盐含量高的肉制品,体内磷酸盐的不断积聚会影响钙的吸收,容易导致骨质疏松症。目前,大多数肉制品中磷酸盐的含量控制在0.2%-0.3%,既安全,又能改善肉制品的各项功能特性。

磷酸盐是肉制品的一种有效的保水剂。生产中大多使用碱性磷酸类.其中以焦磷酸钠、三聚磷酸钠和六偏磷酸钠为最好。其保水机理可从以下几方面考虑:

提高肉pH。磷酸盐呈碱性，可使肉的pH向碱性偏移.远离蛋白质等电点.从而提高肉的保水性。

与肌肉中金属离鳌合。加入磷酸盐后.原来与肌肉中结构蛋白结合的Ca2+、Mg2+ 可被聚磷酸盐鳌合，蛋自质释放出羧基。由于羧基同性电荷相斥作用，使蛋白质结构松驰，可吸收更多的水分。

增加肉离子强度。磷酸盐溶液中的高价阴离子可增加肌肉的离子强度.有利于肌球蛋白B 转变为溶胶状态.亲水性增强。

解离肌动球蛋白。磷酸盐将肌动球蛋白解离为肌球蛋白和肌动蛋白.肌球蛋白的增加也可使肉的保水性提高。

抑制蛋白质变性。肌球蛋白是决定肉保水性的重要因素.但对热不稳定.在盐溶液中30℃就开始变性.保水能力降低.而焦磷酸盐对肌球蛋白的变性有一定抑制作用.可使肌肉蛋白质的保水能力稳定。

偏磷酸盐在煮制时能加速蛋白质的胶凝作用。表面的蛋白质一经凝固.肉制品内部的水不