第一章 克隆载体
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(1)构建cDNA文库
(2)克隆外源目的基因
二.粘粒(cosmid)
λ噬菌体克隆外源DNA能力，最大23kbp， 较为有效的克隆为15kbp 在研究基因组功能时，需要更大克隆能 力的载体，于是，提出cosmid
粘粒定义:
包含λ噬菌体cos位点的质粒，因此，质粒 DNA在体内可以被噬菌体衣壳蛋白包裹。
Ti:致植物冠瘿瘤的质粒
二. 构建克隆载体的基本策略
(1)具有有效的复制起始位点(Ori)
松弛型最好
(2)多克隆位点(MCS)
(3)标记基因
(4)DNA分子尽可能小 (5)可组装特殊元件 表达型(带有启动、终止序列)、 同源重组型
三.质粒克隆载体的构建
1.大肠杆菌质粒克隆载体pBR322 来源: 由质粒ColE1衍生的pMB1为出发质粒
(3)Con区（regions encoding conjugations）
该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之 间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。
(4)Ori区（origin of replication）
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
双元载体系统（binary vecter） ： 由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质 粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基 因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA 转移,故称之为反式载体（trans vecter）
双元载体系统的构建原理 (1)双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti 质粒和辅助Ti质粒 (2)Ti质粒上的Vir基因与T-DNA具有反式互 补作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的 转移。其次，中间载体含有广泛寄主范围 质粒的复制起始点（oriV），而代替了共 整合载体中用以重组的同源区，能够在任 何农杆菌寄主里自发复制。
替代型载体
gtWESλB 替换型：
最大可达15.5 最小0.7kb
插入型：
不大于10.6kb
(2)标记基因 Spi- ：外源取代red、gam基因 lacZ基因: 蓝白斑
(3)建立外包装系统 转染(transfection)：裸露DNA 转导(transduction)：包装后，噬菌体颗粒介导
缺点: (1)存在嵌合现象(chimerism) (2)YAC 克隆的稳定性差 (3)插入片段的分离和纯化困难 (ห้องสมุดไป่ตู้)转化效率低
细菌人工染色体( BAC) 在大肠杆菌F 因子的基础上发展而来的, 其 复制是严谨型的,在每个细胞中仅有1～2 个 拷贝,减小了插入片段发生重组的机率,并且 F 因子能够携带1Mb 的外源片段。
筛选通过抗性、蓝白斑等
BAC 载体的容载能力一般为100～350kb
(1)转化率高 (2)提取质粒较方便 (3)嵌合及重组现象少 (4)筛选目的基因,方便快捷 (5)T7 和Sp6 聚合酶启动子,可以用于转录获得 RNA 探针或直接用于插入片段的末端测序
第5节 特殊用途克隆载体
几种特殊用途载体:
(1)启动子探针克隆载体
(2)诱导表达克隆载体
(3)反义表达克隆载体
(4)组织特异性表达克隆载体 (5)分泌型表达克隆载体 等
dsRNA表达载体
基因克隆载体
DNA克隆载体或基因克隆载体：
将外源DNA带入受体细胞，并在其中得以维持 的DNA分子
DNA克隆载体必须具备的主要条件:
(1)至少有一个多克隆位点(MCS)，供外源基
因插入
(2)自我复制
(3)具有可选择的标记基因
(4)安全，不含有害基因
第1节 质粒克隆载体
一.质粒的性质
1.质粒组成与构型
2.农杆菌Ti质粒克隆载体构建
Ti质粒(tumer inducing plamid):
根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含 有的一种质粒，当农杆菌与植物接触时， 会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤) 双链DNA分子，大小在200-250kbp之间
根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱 种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型： 章鱼碱型(octopine)、 胭脂碱型(nopaline)、 农杆碱型（agropine）、 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱 型(succinamopine)
6.质粒迁移
结合质粒(conjugative plasmid)
含有tra基因，指令宿主形成菌毛(pilus)
如: 质粒F、Ti、ColV2和IncP等
非结合质粒(non-conjugative plasmid)
本身不含tra，不会自行结合转移 如：质粒ColE1、pPbS等
迁移作用(molilization):
包含cos两端280bp以上的序列以及包装相关序 列。剩余部分为质粒，具有质粒的性质。 进行有效包装，插入片断后，总大小要在36.451bp之间
粘粒的特点:
(1)具有部分λ噬菌体特点
体外包装后，高效转导敏感型大肠细胞，
进入后环化
(2)具有质粒特点
复制、抗性
(3)高容量克隆能力 极限可达45kbp
质粒:染色体外裸露的双链DNA分子
广泛存在于细菌，在真菌、蓝藻、绿
藻中也有发现 大肠杆菌质粒特性分:F型、S型、Col型
构型:超螺旋共价闭环(ccc-DNA)、开环 (oc-DNA)、线形(l-DNA)
2.质粒的大小
<2kb 或>100kb
相当于染色体大小的3%
4.质粒DNA的复制
a.严紧型(stringent plasmid): 拷贝数少(1到几个)
宿主细胞中λ噬菌体的包装过程
头部:
E蛋白占72%：头部主要组成成分
琥珀突变导致尾部蛋白积累
D蛋白占20%: DNA进入头部前体以及头部
成熟作用
琥珀突变导致头部蛋白积累
D基因缺失突变株(D-): 溶原菌菌株BHB2690
E基因缺失突变株(E-) 溶原菌菌株BHB2688
λ噬菌体克隆载体的应用
(Pl2derived artificial chromosome ,PAC)
酵母人工染色体( YAC)
YAC 载体的复制元件是其核心组成成分:
大肠杆菌中复制起始位点(ori)
其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列 即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS） 用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN） 两个端粒（TEL）
基因定点同源重组(site-specifichomologus recombination)
定位整合克隆载体的几种模式:
(1)内源平台双交换置换克隆载体
(2)外源平台双交换置换克隆载体
(3)内源平台双交换插入克隆载体
(4)内源平台单交换插入克隆载体
定位整合克隆载体的定位整合效率
(1)受体细胞
(2)同源DNA片断长短
总体上整合效率偏低
第4节 人工染色体克隆载体
大片段克隆载体
显著特点是载体的容载能力扩大,约100～ 350kb ,主要有:
酵母人工染色(yeast artificial chromosome ,YAC) 细菌人工染色体
( bacterial artificialchromosome ,BAC)
源于噬菌体P1 的染色体
pBR322的Tcr被乳糖操纵子一段DNA取代
启动子、 调节因子、
β -半乳糖苷酶的α -肽基因 (lacZ’)-改造含MCS
蓝白斑筛选(α互补)
LacZ’基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信 息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 β-半乳糖苷酶实现基因内互补（ α-互补）
IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导下， 作用底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳 糖苷) ,使菌落呈蓝色
λ噬菌体包装必备条件: cos位点
末端酶(teminase)
第3节 染色体定位整合载体
染色体定位整合平台系统(gene integration platform system)
整合平台：外源DNA整合位置
克隆载体: 除一般质粒特征外，具有与整合
平台同源的DNA序列
基因打靶(gene targeting)
有些非结合质粒，本身含有bom(oriT)位 点, 当同时存在mob基因(或存在于辅助质粒 上)，借助于tra基因产物，使非结合质粒转移 到受体菌中
7.显性质粒和隐蔽质粒
显性质粒:
R:抗抗菌素的质粒
Ap或Amp、Cm或Cmp、Km或Kan、Tc或Tet
F:引起细胞结合的育性质粒
Col:产生大肠肝菌素(colicins)的质粒
att位点 attL attR
λ 噬菌体
粘末端结合成的双链称为Cos位点
构建λ噬菌体的基本策略与技术路线：
(1)去除λ非必须区 λ噬菌体包装: 大小51-36.4kb之间 野生型大小为48.5kb 去除非必须片断(复制、裂解等非必须)， 使包装片断尽可能大 同时，抹去一些酶切位点
插入型载体
pMB1的特点:
含有ColE1的松弛型复制起始位点 缺少好的选择标记基因 缺少较好的克隆位点
pBR322的构建 (1)保留ColE1的松弛型复制起始位点
(2)pSF124中Apr
(3)pSC101中Tcr 在抗性基因中带入合适的酶切位点 (4)缺失迁移蛋白mob基因，但保留了bom位点
pUC18/19
Ti质粒可分为四个区:
(1)T-DNA区（transferred-DNA regions）：
T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段 DNA，称为
转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。约25kbp。
T-DNA左右边界(LB、RB)：25bp正向重复序列
TA克隆载体
第2节 病毒(噬菌体)克隆载体
病毒：
DNA（或RNA）和外壳蛋白
噬菌体：
感染细菌的病毒
病毒与宿主关系来分：
温和型病毒
构建载体的好材料
烈性病毒
通过改造，也可用于构建载体
一. 噬菌体
λ溶源性细菌特点：
超感染免疫性
溶原性细菌诱发进入溶菌周期
噬菌体插入大肠杆菌基因组方式
Champbell模型
筛选主要是营养缺陷型
YAC 载体的突出特点是容载能力大 动物的YAC 文库平均插入长度达900～1000kb 植物YAC文库平均插入片段一般为100～350kb
构建基因组文库时,只需要较少的克隆数便可以覆盖整 个基因组,使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱 成为可能,基因组计划得以顺利实施。
b.松弛型(relaxed plasmid):拷贝数较多(10个以上)
质粒复制考贝数控制原理: Cop基因编码阻遏蛋白，结合复制起始位点
松弛型质粒施加氯霉素可大量扩增质粒
氯霉素抑制蛋白合成，影响了基因组
DNA的合成
5.质粒的不亲合性:
亲缘关系较近的质粒一般不亲合
解释1: inc基因合成质粒复制阻遏物 解释2: 膜结合位点饱和
右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有 所变化。其核 心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。
内部为:ocs、nos、引发肿瘤相关基因(Onc基因)
(2)Vir区（virulence region）
该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒区。 T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。
(2)克隆外源目的基因
二.粘粒(cosmid)
λ噬菌体克隆外源DNA能力，最大23kbp， 较为有效的克隆为15kbp 在研究基因组功能时，需要更大克隆能 力的载体，于是，提出cosmid
粘粒定义:
包含λ噬菌体cos位点的质粒，因此，质粒 DNA在体内可以被噬菌体衣壳蛋白包裹。
Ti:致植物冠瘿瘤的质粒
二. 构建克隆载体的基本策略
(1)具有有效的复制起始位点(Ori)
松弛型最好
(2)多克隆位点(MCS)
(3)标记基因
(4)DNA分子尽可能小 (5)可组装特殊元件 表达型(带有启动、终止序列)、 同源重组型
三.质粒克隆载体的构建
1.大肠杆菌质粒克隆载体pBR322 来源: 由质粒ColE1衍生的pMB1为出发质粒
(3)Con区（regions encoding conjugations）
该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之 间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。
(4)Ori区（origin of replication）
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
双元载体系统（binary vecter） ： 由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质 粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基 因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA 转移,故称之为反式载体（trans vecter）
双元载体系统的构建原理 (1)双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti 质粒和辅助Ti质粒 (2)Ti质粒上的Vir基因与T-DNA具有反式互 补作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的 转移。其次，中间载体含有广泛寄主范围 质粒的复制起始点（oriV），而代替了共 整合载体中用以重组的同源区，能够在任 何农杆菌寄主里自发复制。
替代型载体
gtWESλB 替换型：
最大可达15.5 最小0.7kb
插入型：
不大于10.6kb
(2)标记基因 Spi- ：外源取代red、gam基因 lacZ基因: 蓝白斑
(3)建立外包装系统 转染(transfection)：裸露DNA 转导(transduction)：包装后，噬菌体颗粒介导
缺点: (1)存在嵌合现象(chimerism) (2)YAC 克隆的稳定性差 (3)插入片段的分离和纯化困难 (ห้องสมุดไป่ตู้)转化效率低
细菌人工染色体( BAC) 在大肠杆菌F 因子的基础上发展而来的, 其 复制是严谨型的,在每个细胞中仅有1～2 个 拷贝,减小了插入片段发生重组的机率,并且 F 因子能够携带1Mb 的外源片段。
筛选通过抗性、蓝白斑等
BAC 载体的容载能力一般为100～350kb
(1)转化率高 (2)提取质粒较方便 (3)嵌合及重组现象少 (4)筛选目的基因,方便快捷 (5)T7 和Sp6 聚合酶启动子,可以用于转录获得 RNA 探针或直接用于插入片段的末端测序
第5节 特殊用途克隆载体
几种特殊用途载体:
(1)启动子探针克隆载体
(2)诱导表达克隆载体
(3)反义表达克隆载体
(4)组织特异性表达克隆载体 (5)分泌型表达克隆载体 等
dsRNA表达载体
基因克隆载体
DNA克隆载体或基因克隆载体：
将外源DNA带入受体细胞，并在其中得以维持 的DNA分子
DNA克隆载体必须具备的主要条件:
(1)至少有一个多克隆位点(MCS)，供外源基
因插入
(2)自我复制
(3)具有可选择的标记基因
(4)安全，不含有害基因
第1节 质粒克隆载体
一.质粒的性质
1.质粒组成与构型
2.农杆菌Ti质粒克隆载体构建
Ti质粒(tumer inducing plamid):
根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含 有的一种质粒，当农杆菌与植物接触时， 会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤) 双链DNA分子，大小在200-250kbp之间
根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱 种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型： 章鱼碱型(octopine)、 胭脂碱型(nopaline)、 农杆碱型（agropine）、 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱 型(succinamopine)
6.质粒迁移
结合质粒(conjugative plasmid)
含有tra基因，指令宿主形成菌毛(pilus)
如: 质粒F、Ti、ColV2和IncP等
非结合质粒(non-conjugative plasmid)
本身不含tra，不会自行结合转移 如：质粒ColE1、pPbS等
迁移作用(molilization):
包含cos两端280bp以上的序列以及包装相关序 列。剩余部分为质粒，具有质粒的性质。 进行有效包装，插入片断后，总大小要在36.451bp之间
粘粒的特点:
(1)具有部分λ噬菌体特点
体外包装后，高效转导敏感型大肠细胞，
进入后环化
(2)具有质粒特点
复制、抗性
(3)高容量克隆能力 极限可达45kbp
质粒:染色体外裸露的双链DNA分子
广泛存在于细菌，在真菌、蓝藻、绿
藻中也有发现 大肠杆菌质粒特性分:F型、S型、Col型
构型:超螺旋共价闭环(ccc-DNA)、开环 (oc-DNA)、线形(l-DNA)
2.质粒的大小
<2kb 或>100kb
相当于染色体大小的3%
4.质粒DNA的复制
a.严紧型(stringent plasmid): 拷贝数少(1到几个)
宿主细胞中λ噬菌体的包装过程
头部:
E蛋白占72%：头部主要组成成分
琥珀突变导致尾部蛋白积累
D蛋白占20%: DNA进入头部前体以及头部
成熟作用
琥珀突变导致头部蛋白积累
D基因缺失突变株(D-): 溶原菌菌株BHB2690
E基因缺失突变株(E-) 溶原菌菌株BHB2688
λ噬菌体克隆载体的应用
(Pl2derived artificial chromosome ,PAC)
酵母人工染色体( YAC)
YAC 载体的复制元件是其核心组成成分:
大肠杆菌中复制起始位点(ori)
其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列 即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS） 用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN） 两个端粒（TEL）
基因定点同源重组(site-specifichomologus recombination)
定位整合克隆载体的几种模式:
(1)内源平台双交换置换克隆载体
(2)外源平台双交换置换克隆载体
(3)内源平台双交换插入克隆载体
(4)内源平台单交换插入克隆载体
定位整合克隆载体的定位整合效率
(1)受体细胞
(2)同源DNA片断长短
总体上整合效率偏低
第4节 人工染色体克隆载体
大片段克隆载体
显著特点是载体的容载能力扩大,约100～ 350kb ,主要有:
酵母人工染色(yeast artificial chromosome ,YAC) 细菌人工染色体
( bacterial artificialchromosome ,BAC)
源于噬菌体P1 的染色体
pBR322的Tcr被乳糖操纵子一段DNA取代
启动子、 调节因子、
β -半乳糖苷酶的α -肽基因 (lacZ’)-改造含MCS
蓝白斑筛选(α互补)
LacZ’基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信 息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 β-半乳糖苷酶实现基因内互补（ α-互补）
IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导下， 作用底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳 糖苷) ,使菌落呈蓝色
λ噬菌体包装必备条件: cos位点
末端酶(teminase)
第3节 染色体定位整合载体
染色体定位整合平台系统(gene integration platform system)
整合平台：外源DNA整合位置
克隆载体: 除一般质粒特征外，具有与整合
平台同源的DNA序列
基因打靶(gene targeting)
有些非结合质粒，本身含有bom(oriT)位 点, 当同时存在mob基因(或存在于辅助质粒 上)，借助于tra基因产物，使非结合质粒转移 到受体菌中
7.显性质粒和隐蔽质粒
显性质粒:
R:抗抗菌素的质粒
Ap或Amp、Cm或Cmp、Km或Kan、Tc或Tet
F:引起细胞结合的育性质粒
Col:产生大肠肝菌素(colicins)的质粒
att位点 attL attR
λ 噬菌体
粘末端结合成的双链称为Cos位点
构建λ噬菌体的基本策略与技术路线：
(1)去除λ非必须区 λ噬菌体包装: 大小51-36.4kb之间 野生型大小为48.5kb 去除非必须片断(复制、裂解等非必须)， 使包装片断尽可能大 同时，抹去一些酶切位点
插入型载体
pMB1的特点:
含有ColE1的松弛型复制起始位点 缺少好的选择标记基因 缺少较好的克隆位点
pBR322的构建 (1)保留ColE1的松弛型复制起始位点
(2)pSF124中Apr
(3)pSC101中Tcr 在抗性基因中带入合适的酶切位点 (4)缺失迁移蛋白mob基因，但保留了bom位点
pUC18/19
Ti质粒可分为四个区:
(1)T-DNA区（transferred-DNA regions）：
T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段 DNA，称为
转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。约25kbp。
T-DNA左右边界(LB、RB)：25bp正向重复序列
TA克隆载体
第2节 病毒(噬菌体)克隆载体
病毒：
DNA（或RNA）和外壳蛋白
噬菌体：
感染细菌的病毒
病毒与宿主关系来分：
温和型病毒
构建载体的好材料
烈性病毒
通过改造，也可用于构建载体
一. 噬菌体
λ溶源性细菌特点：
超感染免疫性
溶原性细菌诱发进入溶菌周期
噬菌体插入大肠杆菌基因组方式
Champbell模型
筛选主要是营养缺陷型
YAC 载体的突出特点是容载能力大 动物的YAC 文库平均插入长度达900～1000kb 植物YAC文库平均插入片段一般为100～350kb
构建基因组文库时,只需要较少的克隆数便可以覆盖整 个基因组,使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱 成为可能,基因组计划得以顺利实施。
b.松弛型(relaxed plasmid):拷贝数较多(10个以上)
质粒复制考贝数控制原理: Cop基因编码阻遏蛋白，结合复制起始位点
松弛型质粒施加氯霉素可大量扩增质粒
氯霉素抑制蛋白合成，影响了基因组
DNA的合成
5.质粒的不亲合性:
亲缘关系较近的质粒一般不亲合
解释1: inc基因合成质粒复制阻遏物 解释2: 膜结合位点饱和
右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有 所变化。其核 心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。
内部为:ocs、nos、引发肿瘤相关基因(Onc基因)
(2)Vir区（virulence region）
该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒区。 T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。