基因工程的基本操作步骤4

（二）利用PCR扩增目的基因
聚合酶链式反应 ①概念：PCR全称为_______________，是一项 体外 特定DNA片段 在生物____复制___________的核酸合成技术 DNA复制 ②原理：__________ 模板DNA 四种脱氧核苷酸 ③条件：___________、_______________、 DNA引物 热稳定DNA聚合酶 、__________ ___________ 、 ___________ 指数 2n ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） 使目的基因的片段在短时间内大量扩增 ⑤结果：_______________________________________________________
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定 氨苄青霉 素抗性基因 四环素 抗性基因
大 肠 杆 菌
四、目的基因的检测与鉴定
个体水平的鉴定
检测对象 目的基因是否导入
方法
DNA分子杂交法 分子杂交法 抗原－抗体杂交法
结果 是否 显示 出杂 交带
目的基因是否转录
目的基因是否翻译
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二、基因治疗曙光初照
1、基因治疗概念：
将健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中， 从而达到治疗疾病的目的。（增补策略）
2、基因治疗的类型
体外基因治疗 体内基因治疗
3、基因治疗的发展现状：
处于初期的临床试验阶段
三、蛋白质工程的崛起
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其 与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或 基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种 新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。 前提： 了解蛋白质的结构和功能 途径： 改造基因（基因修饰或基因合成）
目的： 定向改造或制造蛋白质 获得自然界没有的蛋白质
1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常 用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结 构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过 程如下图所示。请据图回答。
三、将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞
将目的基因导入 ——Ca+处理法 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大 多数单子叶植物没有感染能力 ②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞， 并整合到受体细胞染色体的DNA上。
一、乳腺生物反应器
1.目的基因是什么？ 药用蛋白基因 2.目的基因前需加的什么启动子？ 乳腺蛋白基因的启动子 3.受体细胞是什么？ 受精卵 4.分泌蛋白质的细胞是？ 乳腺分泌细胞 5.将目的基因导入受体细胞的方法？ 显微注射法
练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱 生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科 学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可 以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：
1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞 ， 显微注射 常用方法是___________。 2）进行基因转移是，通常要将外源基因转 到 受精卵 ________中，原因是 ： ① 具有发育的全能性； ② 体积大，易操作。 3）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在 膀胱上皮 小鼠的_________细胞中特异表达。
• 真核生物mRNA的形成
非编码区
RNA聚合酶 结合位点
编码区
非编码区
转录 初级转录物 加工（剪切、拼接） 成熟mRNA 只对应外显子部分
二、表达载体的构建
1、基因表达载体的构建目的
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
2、基因表达载体的组成：
目的基因 启动子 终止子 标记基因
四、目的基因的检测与鉴定 个体水平的鉴定（受体是否表现出相应性状）
1、鉴定转基因抗虫棉是否具有抗虫性可采用 接虫 ___________ 实验
2、如何鉴定转基因抗盐烟草是否成功？
在转基因抗盐烟草田中浇灌盐水，观察其 是否有抗盐特性 3、用乳腺生物反应器生产人血清白蛋白，如何 确定转基因羊培养成功？
3、基因表达载体的构建
①用一定的_________切割 限制酶 质粒，使其出现一个切 黏性末端 口，露出____________。
(插入式)
同一种限制酶 ②用_____________切断目 相同 的基因，使其产生_____ 的黏性末端 ____________。
切口 ③将切下的目的基因片段插入质粒的______处， DNA连接酶 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱 生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科 学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可 以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：
DNA分子杂交 4）通常采用_____________技术检测外源基 因 是否插入了小鼠的基因组 5）检测人的生长激素是否成功表达可采用 抗原--抗体杂交 技术 ___________ 6）与乳腺生物反应器相比，膀胱反应器有什么 优点？ ① 不受性别的限制； ② 没有是否处于生殖期的限制。
（三）人工合成
（化学合成法）
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测
结构基因的核苷酸序列
化学合成（DNA合成仪） 目的基因 较小 已知 若基因_____，核苷酸序列______ ，可用此法。
（三）人工合成
mRNA
（反转录法）
逆转录酶
cDNA单链
DNA聚合酶
cDNA分子
与直接提取的DNA相比cDNA不含有_____ 和_____等结构。
检测羊乳中是否含有人的血清白蛋白
归纳: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因
从基因文库 利用PCR技术 人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射 法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：是否有转基因特性
③过程：
1、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上
2、将重组Ti质粒导入农杆菌 3、用农杆菌感染植物体细胞
（2）基因枪法
适用于
单子叶植物
（3）花粉管通道法
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法 ②程序： 取卵 显微注射
早期胚胎培养 受精卵 胚胎移植
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点： 繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法： 用Ca2+处理细胞
⑥过程 a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 氢键 单链DNA 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 双链 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， DNA链 合成与模板互补的________。 有一段已知目的基因的核苷酸序列 ⑦前提__________________________________________________
1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________ 也有一些具有调控作用的因子 ________________________________________ 2、获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成