白蛋白钴结合试验测定缺血修饰白蛋白方法学评价

白蛋白钴结合试验测定缺血修饰白蛋白方法学评价
论著
李美忠　姜庆波(常州市第一人民医院检验科　江苏　常州　223200)
【摘要】　目的　白蛋白钴结合(A C B )试验测定缺血修饰白蛋白(I M A ),并确定参考正常范围。

方法　应用日立7600-120E 型全自动生化分析仪,采用A C B 法测定I M A 。

结果　A C B 法批内变异系数(C V )为1.43%,批间C V 为1.70%。

不同浓度的I M A 结果线性相关,回归方程为Y=-13.752X +83.835,r =0.9586。

脂血(T G ≤20.5m m o l /L )、黄疸(T B I L ≤259.6),对测定无影响,溶血对I M A 测定影响较大。

健康人群的参考范围为≥62.84U /m l ,心肌缺血患者为54.49U/m l 。

结论　I M A 是诊断心肌缺血的有效工具,应用全自动生化分析仪检测I M A 快速、准确、简便。

【关键词】　心肌缺血　缺血修饰白蛋白　白蛋白钴结合试验
D e t e c t i o no f I s c h e mi a -m o d i f i e d a l b u m i nb y C o b a l t b i n d i n g t e s t .L I M e i -z h o n g ,J I A N GQ i n g -b o .D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,C h a n -g z h o uF i r s t P e o p l e H o s p i t a l ,C h a n g z h o uJ i a n g s u 223200,C h i n a .
【A b s t r a c t 】　O b j e c t i v e I n t h e p r e s e n t s t u d y ,t h e i s c h e m i a -m o d i f i e d a l b u m i n(I M A )i n s e r u ms a m p l e s w a s d e t e c t e d b y t h e A C Bm e t h o d ,a n d i t s r e f e r e n c e r a n g e w a s a l s o d e t e r m i n e d .Me t h o d s I M Aw a s d e t e r m i n e db y t h e a l b u m i n c o b a l t b i n d i n g (A C B )t e s t u s i n g t h e H i t a c h i 7600-120Ea u t o m a t i c b i o c h e m i c a l a n a l y z e r .R e s u l t s C o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n (C V )f o r w i t h i n -r u n a s s a y s w a s 1.43%;C Vf o r b e t w e e n -r u n a s s a y s w a s 1.70%.M e a s u r e m e n t o f A C Bu s i n gd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f I M Aw a s l i n e a r ,r e g r e s s i o ne q u a t i o nw a s Y=-13.752X+83.835,r =0.9586,P >0.05.T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t i n t e r f e r e n c e o b s e r v e d f o r t r i g l y c e r i d e s (T G≤20.5m m o l /L)o r b i l i r u b i n (T B I L≤259.6μm o l /L ).H a e m o -g l o b i nh a d i n t e r f e r e n c e o nt h e A C Bt e s t .H e a l t h y i n d i v i d u a l 's r e f e r e n c e v a l u e w a s ≥62.45U/m l .C o n c l u s i o n I M Am a y b e a n e f f e c t i v e b i o m a r k -e r f o r t h e d i a g n o s i s o f m y o c a r d i a l i s c h e m i a .A u t o m a t i c b i o c h e m i c a l a n a l y z e r p r o v i d e s ar a p i d ,c o n v e n i e n t a n de a s y w a y f o r t h e d e t e c t i o no f I M A . 【K e yw o r d s 】　M y o c a r d i a l i s c h e m i a ;I s c h e m i a -m o d i f i e da l b u m i n ;C o b a l t b i n d i n g t e s t
缺血修饰白蛋白(i s c h e m i a -m o d i f i e da l b u m i n ,
I M A )是一种对心肌缺血敏感的新型标记物。

I M A 是急性冠状动脉综合征(A C S )中心肌缺血发生数分钟后,导致白蛋白受损,其N 末端2～4个氨基酸发生改变而形成,其与过渡金属结合能力较正常白蛋白为低。

其表现为I M A 在心肌缺血发生6h 内能检测到钴结合力明显低于非缺血者。

因此,I M A 是早期反映心肌缺血的一个
新灵敏指标。

2000年B a r -O r 等[1]
用手工法进行I M A 的白蛋白钴结合(a l b u m i n c o b a l t b i n d i n g ,A C B )试验,手工法操作较繁琐,不适合工作量较大时使用,且血清用量较大(200μl )。

鉴于全自动生化分析仪具有加样量少(10～30μl ),且快速、准确、简便的特点,现通过全自动生化分析仪来对A C B 法进行方法学验证,并建立一个适合本试验室的I M A 的参考范围。

1　材料与方法
1.1　一般资料　实验组:常州市第一人民医院2008年4月份内科住院患者,均系急性胸痛入院,临床体征和心电图检查有心肌缺血的证据,就诊时距胸痛发生均<12h ,且最后出院确诊为A C S ,共75例,其中男性48例,年龄31～85岁;女性27例,年龄33～87岁。

均在就诊当时采集血标本,在室温下充分凝集,离心分离血清,确保血清中无纤维蛋白、红细胞和其它微粒,在
2.5h 内完成测定或血清标本快速冷冻至-20℃,冷冻于采血后1h 内完成冻存。

另从中收集17份乙二胺四乙酸二钾(E D T A K 2)
抗凝全血,分离血浆后冰冻保存。

对照组:同一批次体检人员50例,其中男性30例,年龄28～79岁,女性20例,年龄26～65岁。

另选150例作为健康人群,以确立本试验室的参考范围。

均除外
心脏疾病、胃肠、免疫系统疾病及其他缺血性疾病。

均
抽血后在室温下充分凝集,离心分离血清,确保血清中无纤维蛋白、红细胞和其它微粒,于-20℃冰冻保存。

1.2　仪器　日本日立7600-120E 型全自动生化分析仪。

1.3　试剂　长沙颐康科技开发有限公司生产的I M A 测定试剂盒[湘食药监械生产许(2005)第0101号,产品
注册号:湘食药监械(准)字2006年第2400022号,注册
产品标准号:Y Z B /湘0010-2006]批号S J 1102;I M A 标准品(标准值为:70U /m l ,批号:20071009),I M 质控品(标准值:51±470U /m l ,批号:20071009),试剂盒检测线形范围可达180U /m l 。

1.4　方法1.4.1　A C B 试验检测I M A 在待测样品中加入适当浓度的氯化钴溶液,正常对照的血清中白蛋白以活性形式
存在,加入的钴离子可以较牢固地与这种白蛋白结合,溶液中游离的钴离子浓度较低;而心肌缺血患者血清中的白蛋白N 末端结构发生变化,形成I M A ,钴离子与I M A 的结合能力较弱,此时溶液中游离的钴离子浓度就会增高。

加入二硫苏糖醇(D T T )试剂可以与游离钴离子结合产生红褐色反应,I M A 含量与颜色深浅呈正比,在510n m 处检测吸光度变化,即可间接对I M A 进行定量测定。

单位(U /m l )定义每毫升血清中的白蛋白,在510n m 波长下吸附1μg 的钴离子为一个单位。

1.4.2　标准品的定值　先测试剂1(R 1)钴离子浓度,加入标准品血清和试剂2(R 2)后,再测钴离子浓度改变量,推算每毫升血清中的白蛋白吸附钴离子的量,即为标准品的浓度。

·
492·J o u r n a l o f C l i n i c a l a n dE x p e r i m e n t a l M e d i c i n e V o l .9,N o .7　A p r .2010
1.4.3　生化分析仪测定参数设置　标本:21μl ;R 1:140μl ;R 2:70μl ;波长(副/主):750/505n m ;标准品浓
度70U /m l ,反应时间10m i n 。

测定时间为10～34点。

方法:两点终点法。

1.4.4　干扰血清的收集　①脂血样品:收集脂血血清,测定其三酰甘油(T G )和I M A ;②溶血样品:收集E D -T A K 2抗凝全血,离心取底层细胞,生理盐水洗涤三次
后,蒸馏水制成溶血,血红蛋白(H B )浓度控制在20～30g /L ,测定其H B 和I M A ;③黄疸血清:收集黄疸血清,测定其总胆红素和I M A ;④混合血清:健康人群的混合50m l ,用滤纸过滤后充分混匀,测定H B 、T G 、总胆红素(T B I L )和I M A 。

1.4.5　线性试验　将一份混合血清用蒸馏水按比例稀释,每种浓度样品测两次。

1.4.6　复融试验　将一份混合血清分装成10份,测定I M A 后置-20℃冻存,5d 后在室温(18～27℃)下融化,低速振荡或轻柔颠倒混匀后测定I M A ,再冻存5d 后再测定。

1.4.7　血浆与血清对比试验　血浆标本与血清标本按相同方法在同一时间测定。

1.4.8　数据的储存和统计　使用G r a p h P a d P r i s m 4D e m o 处理,结果以均数±标准差( x ±s )表示,回归方程用线性回归分析,健康人群及对照组中男性和女性比较用两独立样本的t 检验,干扰试验用配对样本的t 检验。

2　结果
2.1　精密度　批内变异系数(C V ),取混合血清,做10次平行测定, x =5
3.754U /m l ,s =0.77,C V=1.43%。

批间C V 取冻存分装的混合血清,每天两份,复溶后测
定,连续10d , x =72.1U /m l ,s =1.22,C V =1.70%。

2.2　A C B 线性试验　由于最低检出限为6～10U /m l ,故按表1用蒸馏水对混合血清进行稀释,每浓度测定两次,取其均值,见表1,均值的线性关系见图1。

表1　线性试验　(I M A :U/m l )
蒸馏水∶混合血清I M A (1)I M A (2)I M A 混合血清
73.3172.48
72.9
1.25∶160.7760.860.792∶136.2135.7736.003∶12
2.3421.3921.874∶117.3716.2016.798∶1
6.39
5.32
5.
86
图1　线性关系
2.3　干扰试验2.
3.1　脂血干扰　将混合血清与高三酰甘油血清(T G
=21.46m m o l /L )按表2混合后测定,结果见表2,测得的I M A 与理论的I M A 测定值差异无统计学意义(t =
1.031,0.1<P <0.2)。

表2　脂血干扰　(I M A :U/m l ;T G :m m o l /L )
混合血清∶高三酰甘油血清
T G
I M A
理论I M A
混合血清
1.2054.74高三酰甘油血清21.4664.791∶2020.5063.1964.31
1∶1019.6062.9563.881∶518.0862.6963.1151∶2.515.6762.161.921∶1.25
11.93
60.93
60.32
2.3.2　溶血干扰　将混合血清与溶血标本按表3混合
后测定,结果见表3,测得的I M A 与理论的I M A 测定值
差异有统计学意义(t =5.65,P <0.0005)。

表3　溶血干扰　(I M A :U/m l ;H B :g /L )溶血样本占混合后样本比例测得H B I M A 理论I M A
混合血清
54.74
溶血标本26.034.440.820.838.7838.50.615.640.3642.56
0.513.041.7844.590.410.442.8846.620.25.247.6850.680.12.650.0952.710.051.350.7653.7250.01
　0.26
52.48
54.537
2.3.3　黄疸干扰　将混合血清与高胆红素血清(T B I L
=266.6μm o l /L )按表4混合后测定,测得的I M A 与理
论的I M A 测定值差异无统计学意义(t =0.905,0.2<P<0.25)。

表4　黄疸干扰　(I M A :U/m l ;T B I L :μm o l /L )
混合血清∶高胆红素血清T B I L I M A 理论I M A
混合血清
　7.20
54.74
高胆红素血清266.6053.141∶20259.6052.7553.221∶10244.1053.3853.29
1∶5222.2053.3953.401∶2.5192.4953.5153.601∶1.25
151.31
53.88
53.85
2.4　复融试验冻存标本测定 x 1=71.87U /m l ,s 1=1.51; x 2=71.20U /m l ,s 2=1.27; x 3=71.26U /m l ,s 3
=1.32,三组结果两两比较,t (1:2)=1.619,0.10>P >0.05;t (1:3)=0.911,0.20>P >0.10;t (2:3)=0.104,P >0.25,三组数据无明显差异。

2.5　血清与血浆的比较　测定的17份血浆的I M A 值( x =176.03U /m l ,s =0.73)与血清组I M A 值(
x =54.5U /m l ,s =6.91),两者的差异有统计学意义
·
493·临床和实验医学杂志　2010年4月　第9卷　第7期
(P <0.0001)。

2.6　健康人群参考范围　取双侧95%可信区间,200例白蛋白在正常范围的体检人员A C B 法测定均值为62.45U /m l ,男性58.05～68.86U /m l ,女性54.56～67.23U /m l 。

男、女性A C B 测定值差异无统计学意义(t =1.42,P >0.05)。

由于在缺血时患者I M A 升高,而A C B 测定值是降低的,因此,只有低A C B 值是异常的,所以计算两侧超过95%参考值上限的值是62.84U /m l 。

2.7　临床应用　对照组:男性30例, x =62.8U /m l ,s =2.53;女性20例, x =61.67U /m l ,s =
3.07,男女性A C B 测定值无统计学意义(P =0.1900)。

故合并统计, x =62.45U /m l ,s =2.75。

缺血组: x =5
4.49U /m l ,s =6.85,缺血组与对照组比较差异有统计学意义(t =7.80,P <0.0001),缺血组有65例低于参考值,阳性率为86.7%,散点图见图2。

图2　心肌缺血组与对照组A C B 法散点图
3　讨论A C S 是由于急性心肌缺血导致胸部不适和其他症状的一大类病症,是临床上常见的心脏、血管急症,也是造成急性死亡的主要原因。

而目前基本的临床工作如病史,体检及心电图(E C G )用作A C S 的诊断其敏感性和特异性有限,以致2%～5%的心肌梗死(M I )患者由于疏忽而被遗漏;另外,有50%以上住院观察评价胸痛的患者,最终的诊断却不是A C S ,这样导致了因治疗不当而延误病情。

另外心脏肌钙蛋白(c T n )虽然对检出心肌损害是敏感和特异的,但是在可逆性心肌缺血时并不升高。

急诊室需要一个快速评估非创伤性胸痛的工具。

M o r r o w 等[2]
指出,理想的心肌缺血标志物应具备
以下特征:①灵敏度及特异性均高,必须能检测心肌缺
血,但在健康个体、炎症及其他器官损伤期间均不增加;②心肌缺血期间应该能够早期检测,且与心肌受累的范围成比例增加;③在循环中稳定性好,可持续检测以保持一个足够的期间,提供一个适宜的诊断窗口期;④24h 内血中浓度恢复到基础水平,以便检测复发性缺血,使劳累缺血的稳定性冠脉病的混淆减到最小;⑤试验方法简单,T A T (来回时间)应为30～60m i n 或更短;⑥应有可靠的分析特性、精密度良好(C V %低);⑦合理的价格。

I M A 通过A C B 法测定,是唯一一个美国药品监督
管理局(F D A )[3]
批准的用于排除A C S 风险患者试验
[4]。

I M A 水平在经皮冠状动脉介入(P C I )后几分钟
到2h 显著升高,6～12h 回到基线[5]
,I M A 升高的程度
与返回基线的时间和缺血严重程度有关。

I M A 、E C G 和c T n T 的单独和综合的结果与无缺血性胸痛、不稳定心绞痛、S T 段升高和无S T 段升高的心肌梗死的最后诊断相关。

在S i n h a 等[6]
试验的整个患者组中,I M A 对源于缺血的胸痛的敏感性为82%,而E C G 为45%,c T n T 为
20%。

I M A 与c T n T 或E C G 相结合的敏感性分别为
90%和92%。

3项检查相结合可确诊95%因缺血性心脏病引起胸痛的患者。

在不稳定心绞痛患者中,单独I M A 检查的敏感性(82%)仅略小于于I M A 和E C G 相结合者(92%)。

因此与传统检验手段相比,I M A 对表现为急性胸痛患者的心肌缺血的诊断具有更高的敏感性和阴性预测值,这使I M A 具有优势的早期检出A C S 或
排除A C S 的能力。

但特异性低要考虑其他影响因素。

现I M A 已制成商业用试剂盒,可以在试验室的全自动生化分析仪上使用。

由于A C B 法是一个间接测定I M A 的试验,所以我们测定了A C B 法的线性、精密度、干扰试验、冻存试验和正常人群的参考范围。

发现A C B 法的批内C V 、批间C V 分别是1.43%和1.70%,符合1999年临床生物化学委员会国家学院推荐的冠状动脉疾病的新标志物要求
[7]
,与试剂商提供的数据(批内C V
≤4.5%,批间C V ≤5%)相比,值较小,可能是由于试
剂商试验时标本数较大。

通过干扰试验,发现脂血(T G ≤20.5m m o l /L )、黄疸(T B I L ≤259.6μm o l /L ),对测定无影响,而溶血对A C B 法测定影响较大。

另外,在准备溶血标本时,先采用了冰冻抗凝全血溶血法,测得其I M A>170U /m l ,怀疑红细胞内含有I M A 相关物质。

后采用红细胞溶解法,去除了血浆干扰,发现洗涤红细胞破坏释放的物质中能测出I M A ,其浓度与血红蛋白的浓度正相关。

通过线性试验,发现I M A 结果与A C B 法具有很好的线性相关关系。

测定I M A 时不能使用测定血常规所用的抗凝血浆,因为抗凝剂大多为E D T A-K 2-H 2O 或E D T A -N a 2-H 2O ,其金属离子能与钴离子竞争性白蛋白结合,从而影响I M A 的测定。

目前尚没有统一的A C B 测定值,我们测得的临界
值是62.84U /m l ,男、女性A C B 值差异无统计学意义(P =0.1900),与试剂商提供的参考值(A C B >64.7U /
m l )基本一致。

贾克刚等[8]
报道的多中心的结果中,绘制A C B 法的受试者工作特征(R O C )曲线来反映的临界值(80U /m l )相比为小,可能是受试人群之间的差异。

男、女A C B 值差异无统计学意义与参考文献[9]报道的
男、女无差异相一致(t =0.994,P >0.05)。

临床应用中,缺血组有65例低于参考下限,阳性率为86.7%。

与参考文献[7]所述相近。

·494·J o u r n a l o f C l i n i c a l a n dE x p e r i m e n t a l M e d i c i n e V o l .9,N o .7　A p r .2010
儿童噬血细胞综合征临床特征分析论著陈颖　赵晓东(宜宾市第一人民医院儿科　四川　宜宾　644000)
【摘要】　目的　探讨儿童噬血细胞综合征(H L H)的临床表现特征,影响H L H预后的危险因素及合理用药。

方法
　回顾性分析23例H L H患儿的住院病历资料,并应用S P S S13.0统计软件进行统计分析。

结果　将患儿按预后分为
好转组与恶化组进行比较,发现两组患儿在地塞米松的使用上差异性显著(P<0.05);将单因素分析筛选出的可能有
意义的变量再进行L o g i s t i c回归分析,显示在本次研究中地塞米松是影响H L H预后的显著相关因子。

对17例证实有
E B病毒(E B V)感染的患儿进行分析,发现B淋巴细胞计数(C D19)及使用地塞米松对E B V-H L H预后的影响具有统计
学意义(P<0.05)。

结论　儿童H L H的治疗过程中应注意继发感染及弥散性血管内凝血的出现,在严格按照H L H-
04标准进行治疗的同时,是否存在仅用激素及对症治疗就可控制的“轻症”H L H有待进一步研究。

【关键词】　噬血细胞综合征　儿童　临床特征　治疗
C l i n i c a l f e a t u r e s o f h e mo p h a g o c y t i c l y mp h o h i s t i o c y t o s i s i nc h i l d r e n.C H E N Y i n g,Z H A O X i a o-d o n g.
D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s,T h e F i r s t
P e o p l e's H o s p i t a l o f Y i b i n,Y i b i n,S i c h u a n644000,C h i n a.
【A b s t r a c t】　O b j e c t i v e　T o s t u d y t h e c l i n i c a l f e a t u r e s,r i s kf a c t o r s a n dr a t i o n a l t r e a t m e n t o f h e m o p h a g o c y t i c l y m p h o h i s t i o c y t o s i s(H L H)i n
c h i l
d r
e n.Me t h o d s　T h e m e d i c a l d a t a o f23c a s e s o
f H L Hh o s p i t a l i z e di n C h i l d r e n H o s p i t a l a f f i l i a t e d t o C h o n
g q i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y f r o mN o v e m-
b e r2004t o J a n u a r y2010w e r er e v i e w e d a n dt h e i r
c l i n i c a l f e a t u r e s w e r e a n a l y z e d.R e s u l t s　A l l t h e s e c a s e s w e r e
d i v i d
e d i n t oi m p r o v e d g r o u p a n d
d e p r a v e dg r o u p,w e f o u n d t h a t p r o m i n e n t d i f f e r e n c e r e v e a l e d o na p p l i c a t i o n o f d e x a m e t h a s o n e b e t w e e nt h e s e t w o g r o u p s(P<0.05).A f t e r a n a l y-
z i n g t h ed a t a o f17c a s e s o f E B V-H L H,w e f o u n dt h a t t h e n u m b e r o f Bl y m p h o c y t e s C D19a n d a p p l i c a t i o no f d e x a m e t h a s o n e c a np r o m i n e n t l y i n-
f l u e n c e t h ep r o
g n o s i s o f p a t i e n t s.C o n c l u s i o n　C l i n i c a l p
h y s
i c i a n s s h o u l dp a y s p e c i a l a t t e n t i o n t o s e c o n d a r y i n f e c t i o n s a n d D I Co c c u r r e d d u r i n g t h e
t r e a t m e n t c o u r s e f o r H L H.T h e p r o b l e ma b o u t"m o d e s t H L H"c a nb ec o n t r o l l e db y d e x a m e t h a s o n ea l o n eo r n o t n e e d s f u r t h e r s t u d y.
【K e yw o r d s】　H e m o p h a g o c y t i c l y m p h o h i s t i o c y t o s i s;C h i l d r e n;C l i n i c a l f e a t u r e s;T r e a t m e n t
噬血细胞综合征(h e m o p h a g o c y t i c l y m p h o h i s t i o c y t o-s i s,H L H)是一种以遗传性或获得性免疫缺陷为基础,以“难以控制”的“过度炎症反应”为特征的威胁生命的疾病。

其主要症状包括发热,肝脾肿大,全血细胞减少,脂类代谢及肝功能异常,以及在骨髓及其他组织中出现异常增多的组织细胞吞噬自身血细胞的现象。

H L H病因多样,起病急,症状凶险,如不及时诊治易威胁生命[1]。

为提高对该病的认识,现将我院2004年11月至2010年1月收治的23例儿童H L H病例进行回顾性分析如下,探讨影响H L H预后的危险因素,提示H L H的可能辅助诊断指标及合理用药。

1　资料与方法
1.1　一般资料　收集宜宾市第一人民医院2004年11月至2010年1月收治的H L H病例共23例患儿住院病历资料。

其中男性15例,女性8例,年龄11个月至14岁9个月,平均年龄5岁10个月。

1.2　诊断　采用H L H-2004方案中的诊断标准[2]: (1)分子生物学符合H L H;(2)符合以下8条中5条:①
综上所述,A C B法应用于全自动生化分析仪上,样品用量小,试剂盒有标准品,易与实验室间参比,结果较为稳定,是一个准确度、精密度均较好的I M A测定方法。

在日立7600-120E生化分析仪上测定,仅需10 m i n的运行时间,适合急诊室使用,也适合大批量标本测定,故也适用于健康人群的普查,可为临床医生排除A C S提供参考依据。

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(收稿日期:2009-12-09)
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临床和实验医学杂志　2010年4月　第9卷　第7期。