空肠弯曲菌

微需氧42 ℃±1℃培养24 h，观察菌落生长情况
平板上杂菌较多 48h增菌液与1:50增菌液划线接种mCCDA和 Skirrow平板或CFA显色平板 48h增菌液划线接种mCCDA和 Skirrow平板或CFA显色平板
微需氧42 ℃±1 ℃、24 h 挑取24 h和48 h mCCDA和 Skirrow平板上的可疑菌落、 或CFA显色平板与Simplate培养基上的可疑菌落 转种
2.1 各类型样品前处理 2.1.1 一般样品 2.1.2 整禽等大样 2.1.3 棉拭子样品 2.1.4 贝类 2.1.5 蛋黄液或蛋浆 2.1.6 鲜乳及制品 2.1.7 水样
样品处理 预增菌 36 ℃±1 ℃ 4h 增 菌 42 ℃±1 ℃ 24 h～48 h
国标稿
接种Skirrow 与mCCDA琼脂平板 42 ℃±1 ℃ 24 h～48 h


Robinson曾证明：牛奶中空肠弯曲菌含量达到 2～3 CFU/mL，就可感染成人产生肠炎症状。 大多数商业上饲养的家禽，都带有弯曲菌。屠宰 过程中，空肠弯曲菌又可从肠道内容物扩散到胴 体。少量污染空肠弯曲菌的鸡胴体，如胴体的带 菌量只有103～104 CFU/g，经商业烹煮后，不 会因操作不卫生而再次污染；尚若经人工严重污 染带菌量达106 CFU/g，同样不卫生的操作就可 重新引起污染。
哥伦比亚血平板或Skirrow无抗生素血平板
2.2菌落鉴定流程图
可疑功落
革兰氏染色、 形态观察
直接相差 镜检
氧化酶 实验
微需氧25 ℃±1 ℃ 生长实验
有氧42 ℃±1 ℃ 生长实验
结果相符合者，确定为弯曲菌
过氧化酶实 验
萘啶哃酸 敏感实验
头孢菌素 敏感实验
马尿酸盐 水解实验
吲哚乙酸脂水解实 验
结果相符者为空肠弯曲菌
常规方法检 测 1（10.0） 1（10.0）
中国CDC
浙江CDC 上海CDC
10份
10份 10份
1（10.0）
3（30.0） 5（50.0）
0 (0)
0 (0) 1(10.0)
1（10）
1（10） 2（20）
0（0） ）
0（0） 1（10.0）
表3 空肠弯曲菌常规法检测限的测定
0.5cfu/g
样 品 数 江苏 CDC 福建 CDC 中国 CDC 浙江 CDC 上海 CDC 合计 10 10 10 10 10 50 检 出 数 1 2 1 1 1 6
3. 分离培养 FDA和USDA方法在增菌液接种平板时，都有稀释步骤。 SN采用以0.65μm孔径滤膜过滤除杂菌的方法。GB 和ISO方法则直接接种平板。 但在接种培养时，唯有 ISO方法提出同时接种两种（一种无血，一种有血） 平板。
4. 鉴定
鉴定过程中，都有初步鉴定和最终鉴定，初步鉴定主 要以少数典型生化反应和菌体形态来判断为弯曲菌属， 在此程中各方法不完全一致。但鉴定过程中所采用的 生化反应基本相同。通过初步鉴定可以减少工作量， 建议在鉴定过程中，先对所得菌株进行初步鉴定，先 确定为弯曲菌后，再统一进行进一步生化鉴定。


荧光实时PCR方法的建立 ：反应体系为20µl ， 各成分的最终浓度分别为：1×PCR Buffer（含 Mg 2+ ），Ex Taq HS为1.25 U，引物hipO-F 与hipO-R为0.2µM，hipO-P荧光探针为 0.12µM，细菌DNA模板为2µl，加灭菌超纯水 补足20µl。 经过反应条件的优化，确定检验程序为95℃预 变性10sec，然后采用二步法进行反应：95℃变 性5sec，60℃退火20sec，进行50个循环。
报告
3、快速方法的介绍 3.1生物梅里埃方法与传统方法的结合
样品处理并按传统方法增菌 MINI-VIDAS筛选 阳性 接种普通平板 接种CFA显色平板 阴性 丢弃并报告阴性
传统生化鉴定 VITEK2 API CAMP
报告结果
3.2现场验证结果
表1 鸡肉中空肠弯曲菌的检出数（率%）
参加单位 份数 VIDAS筛选 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） CFA 6 (60.0) 6 (60.0) 7 (70.0) 6 (60.0) 8 (80.0) Simplate CI 常规方法检 测 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） 10（100） 10（100）
1. 0.1ml原增菌液； 2. 人工布菌10~100CFU的 24h增菌培养液； 3. 人工布菌1~10CFU的24小时增菌培养液； 4. 空白对照
所建立检验方法的应用
样 品 修订方法 新鲜鸡80份 75（94%） 猪肉80份 18（23%） 猪粪80份 15（19%） 猴粪80份 24（30%） 冻鸡80份 11（14%） 鸡粪80份 77（96%） FDA 57（71%） 7（9%） 6（8%） 5（6%） 4（5%） 67（84%） USDA 71（89%） 5（6%） 6（8%） 7（9%） 2（3%） 75（94%） ISO 57（71%） 7（9%） 4（5%） 6（8%） 2（3%） 64（80%） GB 65（81%） 4（5%） 12（15%） 18（23%） 0（0%） 73（91%） SN 48（60%） 0（0%） 2（3%） 5（6%） 1（1%） 57（71%） 基因检测方法 77（96%） 30（38%） 21（26%） 31（39%） 19（23%） 78（97%）
一、检测方法
二、研究进展
1、定性检测方法 方法比较 方法建立 基因方法的引入 2、定量检测方法 方法建立：平板涂布和MPN SIMPLATE 计数方法的引入
二、研究进展
1、不同宿主来源空肠弯曲菌野生株资源库的建立及 其耐药性流行病学调查与耐药机制分析 2、空肠弯曲菌flaA、peb1A的克隆、表达及 单克隆抗体的制备
SN 44 （55） 0 （0） 2 （22） 0 （0）
水产品
2、已修订方法的介绍（实验室方法）
2.1 样品检测流程图
样品处理 100 r/min微需氧振荡，30 ℃±1 ℃、3 h，37Fra bibliotek℃±1 ℃、2 h
42 ℃±1 ℃、100 r/min微需氧振荡24 h 和 接种mCCDA和Skirrow平板 或CFA显色平板 0.65 μm孔径滤膜过滤 Skirrow （无抗生素） 继续培养 42℃±1℃ 微 需 氧 ， 100 r/min振荡24 h
C. jejuni检 出总计
80 19 9 5
样品 新鲜光 鸡 新鲜猪 肉 牛肉
份数 80 80 80 80
FDA 60 （75） 4 （21） 3 （33） 3 （60）
USDA 70 （88） 6 （32） 5 （55） 1 （20）
GB 67 （84） 1 （5） 1 （11） 0 （0）
ISO 66 （83） 4 （21） 2 （22） 2 （40）


表4 为空肠弯曲杆菌鉴定结果，过氧化氢酶为第21项反 应，应挑取单个菌落在玻片上进行试验。根据反应结果 判读该菌为空肠弯曲杆菌空肠亚种1。
3、基因检测方法的引入
引物与Taqman荧光探针设计与检测体系的建立
根据EU project No. QLK-CT-1999-00226的研究，挑选已经过国 际协同试验验证通过的检测耐热弯曲菌（空肠弯曲菌、结肠弯曲菌 和海鸥弯曲菌）的引物对16S rRNA（16S rRNA-F: 5’CTGCTTAACACAAGTTGAGTAGG-3’, 16S rRNA-R: 5’TTCCTTAGGTACCGTCAGAA-3’），并且利用软件设计具有自主 知识产权的TaqMan探针16S rRNA-P: 5’- AACCCT GACGCAGCAACGCCGC -3’, 5’端标记荧光报告基团为HEX，3’ 端标记非荧光淬灭基团为Eclipse。

五种国内外较主要的检验方法包括 ISO 10272: 2006（简称“ISO方法”） FDA/CFSAN-2001（简称“FDA方法”） USDA/FSIS:1998（简称“USDA方法”） 国家标准GB/T 4789.9-2003（简称“GB方法”） 行业标准SN0175-92（简称 “SN方法”）
10 cfu/g
检 样 出 品 率 数 (％) 70 90 80 70 90 80 10 10 10 10 10 50 检 出 数 9 10 8 10 8 44
20 cfu/g
检 样 出 品 率 数 (％) 90 10 0 80 10 0 80 88 10 10 10 10 10 50 检 出 数 10 10 10 10 10 50 检出 率(％)
1. 样品前处理 ISO方法在本标准中没有前处理方法。 FDA、USDA将样品分类，并采取不同的前处理方法。 GB方法则缺乏样品处理。 SN方法的样品前处理方法已落伍。
2. 增菌 增菌过程中，FDA、USDA、ISO都有前增菌，而GB 和SN中均没有.前增菌结束后，其他方法直接转入 42℃增菌阶段，而USDA方法推荐加入头孢哌哃，这 与其他方法不同中。通过比较发现，样品的前处理和 增菌对提高样品的分离率很重要 。
江苏CDC 福建CDC 中国CDC 浙江CDC 上海CDC
10份 10份 10份 10份 10份
表2 猪肉中空肠弯曲菌的检出数（率%）
参加单位 江苏CDC 福建CDC
份数 10份 10份
VIDAS筛选 2（20.0） 3（30.0）
CFA 0 (0 ) 1 (10)
Simplate CI 1（10） 0（0）
100 100 100 100 100 100
表4 API鉴定结果
－ ＋ ＋ ＋ －
＋－ － － ＋
－ － ＋ － ＋
－－ ＋ － －
4 讨论

表1可以看出，鸡是空肠弯曲菌的主要宿主，故其检出率较高，此 时VIDAS、Simplate CI、常规方法检测显示出较为一致的检出率。 CFA平板上可疑菌落较多，但阳性数不多，在此水平上的检出率较 其他方法要低。 表2可以看出，由于样品本身带菌量较少，导致分离率低。 表3可以看出当样品染菌量在5 cfu/g时，检出率在70.0％～90.0 － ％之间，平均80.0％；在10 cfu/g时，平均检出率为88.0％；在 20 cfu/g时，平均检出率为100％，在1 cfu/g时，平均检出率为 60.0％，在0.5 cfu/g时，平均检出率为12.0％，故该方法的检测 限定为在25g样品中≥5cfu/g。
HipO基因的荧光实时PCR方法的灵敏度试验
1. 0.1ml原增菌液； 2. 0.1ml的100~1,000CFU梯度的细菌稀释液； 3. 0.1ml的10~100CFU梯度的细菌稀释液； 4. 0.1ml的1~10CFU梯度的细菌稀释液； 5. 空白对照
人工布菌鸡肉样品的HipO基因检测灵敏度试验
江苏出入境检验检疫局 动植物与食品检测中心
一、研究空肠弯曲菌的重要意义
空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是在世 界范围内广泛流行的人兽共患致病菌 ，是引起 人类细菌性腹泻的最重要原因之一, 空肠弯曲菌 肠炎的发病率在发达国家超过细菌性疾病，在发 展中国家几乎等同细菌性疾病 。 世界卫生组织已将该病列为最重要的食源性疾 病之一。
1cfu/g
检 样 出 品 率 数 (％) 10 20 10 10 10 12 10 10 10 10 10 50 检 出 数 5 6 4 3 5 23
5cfu/g
检 样 出 品 率 数 (％) 50 60 40 30 50 46 10 10 10 10 10 50 检 出 数 7 9 8 7 9 40
根据空肠弯曲菌的hipO基因序列，利用LightCyclerRr软件设计特异 的正义引物hipO-F：5’-AAATAGGACTTCGTGC AGATATGG-3’与反义引物hipO-R：5’-ACAATCCATCTTC TATCATTGCCT-3’，设计合成了新型Taqman荧光探针hipO-P： 5’-AGCACCACCCAAACCCTCTTCAGC-3’, 5’端标记荧光报告基 团为FAM，3’端标记非荧光淬灭基团为Eclipse。
挑取可疑菌落，接种哥伦比亚琼脂平板
42 ℃±1 ℃
氧化酶 试验
24 h～48 h 微需氧25℃±1 ℃ 生长试验 有氧42 ℃±1 ℃ 生长试验
镜检
动力试验
弯曲菌属
过氧化氢酶试验
马尿酸钠 水解试验
吲哚乙酸脂 水解试验
头孢菌素 敏感试验
萘啶酮酸 敏感试验
空肠弯曲菌 报告 图1 空肠弯曲菌检验程序
表5 不同方法对各80份样品中空肠弯曲菌检出率（%）