柠檬酸的液体深层发酵生产及应用 龙妮娅

贵阳医学院

医学生物技术专业微生物工程论文

（2010级）

题目柠檬酸的液体深层发酵生产及应用

班级医学生物技术专业2010级

学生姓名龙妮娅

学号 20100101008

完成日期 2013 年 12 月 8 日

柠檬酸的液体深层发酵生产及应用

龙妮娅

摘要：本文通过查阅文献对目前国内生产柠檬酸的主要发酵工艺流程做简单的综述和总结，应用黑曲霉柠檬酸产生菌，采用深层液体发酵法，从菌种的选育、发酵底物的选取、培养条件的选择以及产物分离提取的方法，介绍了柠檬酸的发酵生产流程，另外对于柠檬酸的应用前景和未来的发展趋势做一个简单的概述。

关键词：柠檬酸黑曲霉深层发酵工艺流程

引言

柠檬酸作为最重要的有机酸，外观呈白色颗粒状或结晶粉末状，具有令人心怡的强酸味，安全无毒并且可以被人体直接代谢，作为食品添加剂被广泛应用于各行业；同时，柠檬酸是世界需求量最大的有机酸，也是世界上产量最大的发酵产品之一[1]。

随着发酵工艺的日益改善，我国目前主要是应用黑曲霉柠檬酸产生菌进行深层液体发酵来获取柠檬酸，这也是当今柠檬酸生产的主流技术[2] ，目前世界柠檬酸的产量大约160万吨，中国作为柠檬酸出口第一大国，每年产量约90万吨[3]，并且产量仍然在继续上升，在所有有机酸的市场中，柠檬酸市场占有率 70%以上，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂，足以证明柠檬酸的重要地位。

一、概述

1、柠檬酸的性质

柠檬酸从结构来看是一种三羧酸类化合物，它可以以无水合物或一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时生成无水合物，在冷水中结晶则生成一水合物；柠檬酸是一种较强的有机酸，其水溶液显酸性，并且加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等均会发生反应。

2、柠檬酸在国内的生产简史[4]

我国1967年在黑龙江和平糖厂建立了第一个柠檬酸生产车间，1968年在上海酵母场首先以淀粉为原料深层发酵柠檬酸获得成功，20世纪90年代初期天津工业微生物研究所开始研究以玉米粉为原料的生产工艺，并得到广泛的应用，而后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线；薯干粉深层发酵柠檬酸，原料丰富，工艺简单，不需添加营养盐，产率高，是中国独特的先进工艺。

二、柠檬酸发酵菌种的选育

由于柠檬酸是生物机体三羧酸循环的中间代谢产物，能够合成和分泌柠檬酸的微生物种类很多，但是目前用于大规模工业化生产的只有黑曲霉（Aspergillus niger）菌种[5]。

目前我国柠檬酸生产厂家主要应用的还是天津工业微生物研究所研究选育的黑曲霉TD-01，和上海工业微生物研究所研究选育的黑曲霉Co-827。这两株菌株具有以下优良的生物特性[6]：最高能耐200g/L左右的初糖浓度，能耐高浓度的柠檬酸，在柠檬酸含量高达220g/L的培养基中不影响其生长发育，并且不会分解和代谢柠檬酸，能产生和分泌大量的高活性酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶，在黑曲霉水解大分子多糖的时候，其分泌的酸性α-淀粉酶，能耐最低pH 为2.0，其分泌的糖化酶最低能耐pH 值4.0~4.6，抗微量金属离子的干扰，特别是能抗锰离子、锌离子、铜离子和铁离子，微量金属离子的存在下不影响其产酸量，在发酵过程中孢子发育生成直径 0.1mm左右的菌丝球。

1、柠檬酸产生菌的筛选[7]

柠檬酸产生菌的分离筛选有两种方式，一是收集相当数量的现有菌种，经过分离纯化，从中挑选出优良菌种；二是从自然界中采集大量的含菌样本，分离筛选出优良菌种。若是通过采集含菌样本来分离选育，一般要将含菌样本适当增殖培养，或者将样本的稀释液100ml和10%薯干粉、10%柠檬酸混合，在振荡摇床上于33-35℃下培养3-5d，然后进行分离筛选。

2、产生菌的诱变育种

一般情况下，从自然界分离出来的产柠檬酸菌株都需要经过诱变育种才能获

得高产菌株；最常用的方法有两种：化学诱变剂和物理诱变因子；目前国内普遍使用的柠檬酸产生菌Co-827菌株产柠檬酸13%以上，糖酸转化率为95%以上[8]。

三、柠檬酸发酵工艺流程

柠檬酸的生产方法可以从天然植物中提取和微生物发酵这两种，目前以微生物发酵法生产柠檬酸为主。根据所选用的菌种、原料、发酵条件的不同，生产方法也不样，工业生产方法有表面发酵法、固体发酵和液体发酵法；国内柠檬酸的工业化生产则都是采用液体深层发酵工艺。

1、发酵原料的选取[9]

我国柠檬酸生产的主要原料包括淀粉、葡萄糖、玉米粉、稻米粉、木薯粉等，现在工业化生产大都用薯干，玉米粉为原料。在我国20世纪90年代以前柠檬酸行业还主要是以薯干粉为原料发酵柠檬酸，这种方法生产的产品质量差而且成本高，环境污染严重；到20世纪90年代初期，天津工业微生物研究所开始研究以玉米粉为原料的生产工艺，这样不仅有效地降低了成本，而且对于柠檬酸生产剩余的副产物，通过优化工艺的方式加以合理的利用，减少了废物排放量，有利于环境保护，因此得到广泛的应用。

2、发酵培养基的配制[10]

黑曲霉柠檬酸产生菌是化能异养微生物，只能利用有机碳源。为了满足黑曲霉的生长、繁殖，必须提供足够的碳源、氮源和无机盐，是培养基中的化学物质元素组成和菌体物质元素组成相当，但要使黑曲霉柠檬酸产生菌大量生成和积累柠檬酸，必须控制营养物质的供给，提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对于无机盐物质（如磷、锰、铁、锌等）要求则处于低水平。

（1）斜面培养基：采用土豆琼脂培养基；

（2）种子培养基：15%的玉米粉液化液；

（3）发酵培养基：25%的玉米粉α-淀粉酶液化清液，补充适量玉米浆作氮源。

3、发酵条件的控制

对于发酵罐内温度，pH，溶解氧等都需要进行严格的控制，要使其与黑曲霉柠檬酸产生菌的生长同步。温度一般为33-37℃，低于28℃时菌生产速率太慢不适于柠檬酸的生成，高于37℃则会使其他杂酸产生量增加，不利于后期的分离