蛋白质的含量测定PPT精品课程课件讲义

（七）蛋白质的呈色反应
• ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经
后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 • ⒉ 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子 中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红 色，称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。
水解
引言：蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学
(2)
(NH4)SO4 +2NaOH → 2H2O+Na2SO4 +2NH3 (3) 此法灵敏度低,适用于0.2-1.0mg 氮,误差为2%,费时810小时,将氮转化为氨,用酸吸收后滴定 .
（isoelectric point,PI）。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白 质颗粒带负电荷，小于等电点时则带正电。
• 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。
• 电泳种类：自由界面电泳、区带电泳（纸电泳、凝胶电泳等）
（三）蛋白质的胶体性质
• 蛋白质是生物大分子，分子量可自1万至100万
之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒
三、紫外分光光度法：利用蛋白质对280nm紫外光有
最大的吸光度而采用。
蛋白质 呈色试剂: 酚试剂 磷钼酸--钨酸的混和酸 碱性 烯醇化
半胱氨酸、 酪氨酸、 色氨酸 组氨酸 还原型混和酸 (兰色)
蛋白质肽键
铜离子在pH10条件下螯合在肽键结构中
从而使电子转移到混和酸的显色剂上， 增强了酚试源自文库对蛋白质的敏感性。
科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查
康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、 食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品 中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进 行的一项非常重要的工作。
• 测定蛋白质含量的方法较多 • 基本上都是根据蛋白质的理化性质和 生物学活性建立起来的。
• 目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法 ( Biuret法) Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸收法. 另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,
丧失，称为蛋白质的变性(denaturation)。
• • 1． 蛋白质变性的特征：蛋白质变性的主要特征是生物活性丧失。 2． 蛋白质变性的本质：一般认为蛋白质的变性主要发生二硫键和非共
价键的破坏，蛋白质变性是蛋白质空间构象的改变或破坏，不涉及一级结
构中氨基酸序列的改变。
• 3． 蛋白质变性的意义：在临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂(如疫苗等)的必要条件。
范围之内。蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体，
因为蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这
些颗粒带有相同电荷，相互排斥。蛋白质水溶
液具有胶体溶液的特征。
（四）蛋白质的沉淀反应
• 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电 点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水 膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉 淀。
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蛋白质的含量测定
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
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蛋白质的理化性质
(一)、蛋白质分子的相对分子质量
• 蛋白质是相对分子质量（relative molecular mass, Mr） 很大的生物大分子，其Mr变化范围在6 000—1 000 000 或更大一些。 • 相对分子质量测定：根据化学组成测定最低Mr; 渗透压 法测定相对分子质量; 超离心法测定相对分子质量; 凝胶 过滤法测定相对分子质量; SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测 定相对分子质量
微量凯氏定氮法
•
样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨, 氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分
解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液
被中和的程度可计算得样品氮的含量.以甘氨
酸为例:
H2NCH2COOH +3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (l) (1) 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4
• • •
加高浓度盐类（盐析、盐溶） 加盐使蛋白质沉淀析出－－盐析 加有机溶剂
•
• •
加重金属盐
加某些酸类（生物碱试剂） 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能 沉淀生物碱，称生物碱试剂。
（五）蛋白质的变性、复性与凝固
• 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的 空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物活性的
考马斯亮蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry
法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比 Biuret 法高 100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定 氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
一、凯氏定氮法： 根据蛋白质的含氮量来测定蛋白
质的含量。
公式:每g样品中含氮克数 × 6.25 ×100 二、比色法：利用蛋白质与不同试剂的呈色反应， 测定蛋白质的含量，如双缩尿法和酚试剂法 （lowry’s method）。
立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和 强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此
凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的
凝固作用(protein coagulation)。
(六)蛋白质的紫外吸收
• 蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的 吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一 特性对蛋白质进行定性定量分析。
（二）蛋白质的两性电离
• 蛋白质是由氨基酸组成，其分子末端除有自由的α-NH2和α-COOH
外，许多氨基酸残基的侧链上尚有可解离的基因，这些基团在溶
液一定pH条件下可以解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质 溶液在某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，即成兼性
离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点
• 4. 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白 质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性 (renaturation)。所示。但是许多蛋白质变性后，空间构象 严重被破坏，不能复原，称为不可逆性变性。 • 5. 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于
强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质