血清的制备

1.血清的制备：

血样收集在试验期，每隔35d采1次血，颈静脉采血10mL，待凝血后，5 000r／min 7rain，分离血清后分装，一20~C冰箱中保存。

杨镒峰，魏海军等，不同单宁水平日粮对育成前期雄性梅花鹿生长和血液生化指标的影响[J]，特产研究，2010，08，25

2.尿素浓度的测定方法：

A血清尿素测定是常用的肾功能检测项目之一，其检测方法一直以传统的湿化学方法为主，例如二乙酰一肟法、脲酶一波氏比色法和酶偶联速率法。随着干化学分析技术的发展，干化学法已经成为可以与湿化学测定相媲美的定量分析方法。由于干化学法具有快速、简便等独特的优点，近些年，在我国得到了较为广泛的应用检测原理：在碱性环境下，尿素在脲酶作用下水解生成氨气，氨气和指示剂反应发生颜色变化，生成氨气的量和显色程度成比例关系，从而可达到对血清尿素定量检测的目的。

测试方法：

将5 l血清样本滴加至加样，此时迅速将试纸条插入反射式分光光度计测试槽内，同时仪器自动开始计时，反应环境温度为37±0．2℃，测试时间为100 S。

定标方法：收集正常体检者血清，制得混合血清，分成6等份，其中一份使用7 g／dl BSA 稀释一倍，往其中4份添加不同量的尿素标准品。制备含不同浓度尿素的血清样本。6份样本使用脲酶一谷氨酸脱氢酶速率法(科华尿素氮液体试剂盒，日立7020生化分析仪)定值，每份样本重复测定两次。依此定值血清作为临时校准品校准自建尿素测试方法。使用自建方法测试临时校准品，每份样本重复测定3次，记录100 S处反射吸光度值，拟合标准曲线。将确定的标准曲线输入仪器，每批试纸条只需定标一次，以后测试无需再定标。

宁绍华，朱世成，王缦，快速定量检测血清尿素含量干化学方法的建立[J],现代检验医学杂志,2010.1.49

B目前主要测定方法有尿素酶速率法、尿素酶电极法、二乙酰一肟法和流动注射分析法等，其中二乙酰一肟法应用最为广泛，但具有线性范围窄、反应~,-tl可长、易褪色和影响因素多等的缺点。为了克服这些不足，建立了一种快捷、方便的尿素检测方法一对对二甲基氨基苯甲醛显色法，其原理是对二甲基氨基苯甲醛可以与尿素反应生成带柠檬黄绿色的物质，颜色的与一定浓度范围的尿素呈线性相关。此外，该反应的最佳反应温度25℃，显色时间5 min 就达到稳定，即可进行比色测定。通过对两种不同方法的测定结果比较，探讨对二甲基氨基苯甲醛显色法代替二乙酰一肟法，作为尿素含量测定方法的可行性。

1 材料与方法

1．1 仪器和试剂722型分光光度计。100 mmol／L尿素标准液；179．9 mmol／L二乙酰一肟溶液；显色剂：二甲基氨基苯甲醛0．2 g，溶于9 rnl无水乙醇后，加入1 ml浓盐酸。酸性试剂：离子水约100 ml，然后加入浓硫酸44 ml、85％磷酸66 ml。冷至室温后，加入

氨基硫脲50 mg及硫酸镉2 g，溶解后稀释至1L

1．2 方法

二乙酰一肟法取尿素标准液在0—25 mmol／L范围内，从高到底稀释为5个浓度后，分别取0．01ml加入各试管中后，加入5|nJ酸性试剂和0．5 rnl二乙酰一肟溶液，混匀，置沸水浴加热12 min，取出置冷水中冷却5 min，以超纯水调零，测定A540吸收测定值，做出标准曲线，计算样品的尿素浓度。对二甲基氨基苯甲醛显色法取尿素标准液在0～70 mmol／L范围内，从高到底稀释为稀释为7个浓度，分别取0．5 ml加入各试管中后．加人5．25 rnl超纯水和0．5 m1显色液。以超纯水调零，测定A4如吸收值，做出标准曲线，计算样品的尿素浓度。

曹昭，万敏，孙陆果，胡小平，于永利，王丽颖，张培因, 两种尿素浓度测定方法的比较[J],中国实验诊断学，2010.1.135

3.尿酸的测定方法

尿酸分子式为c5H14N4o3，MW 168．11，不溶于水，也难溶于酸。尿酸是一种含有嘌呤结构的化合物，也是嘌呤的最重要衍生物。它是一种白色结晶性物质，极难溶于水，也难溶于醚和乙醇，具有弱碱性，可以与强酸成盐。尿酸在生物体内以盐的形式存在，因而溶解度较高。尿酸在尿酸酶的作用下，可以被氧化成尿素囊，其反应式如下：

通过检测该反应过程中尿酸在292nm处吸光度的降低(尿酸酶在293rma处不产生光吸收)，目前建立了许多尿酸的检测方法。如酶法、尿酸生物传感器检测法等。

1 酶法

如果从动力学角度对目前所使用的酶试剂加以分类，可分为单酶法和酶偶联法。目前临床上常用检测尿酸的方法是单酶法，其基本原理是通过单一的酶促反应后利用各种方法直接测定底物或产物的浓度来求得待测物含量。酶学方法测定尿酸，其反应式如下：

反应在磷酸盐缓冲体系中进行，将试剂混匀，20～25℃孵育30分钟或3TC恒温孵育l0分钟，以试剂空白作对照在60分钟内读取吸光度值，要注意的操作参数是：温度：25℃、30℃、或37℃，波长：520nm，比色杯光径：lcm，用试剂空白调零点。

计算：尿酸浓度=(△A标本／AA标准)x标准品浓度

换算：Uric acid[mg／d1]59．48=Uric acid[umol／L]

随着研究的进展，发现此法虽然操作简便，样品处理简单，但操作过程太复杂。在此基础上人们提出了一种利用固相酶技术制作的一种尿酸传感器检测方法，并且此方法逐渐被尿酸传感器检测方法取代。

2 尿酸传感器检测法

目前，最常用的尿酸检测方法是尿酸氧化酶的尿酸传感器检测法。尿酸传感器_l J采用流动注射分析系统，由样品混合器，恒流泵，覆盖酶膜的氧化极、流动池、热交换器、循环

恒温水浴锅、溶氧控制器和积分仪组成，当一定的试液注入样品混合器后，与流速为1．5ml ／min的0．02mol／L磷酸缓冲液(PH8．5)混合，一起经热交换器恒温(32±0．1)℃，再进入反应室在固定化酶催化下进行氧化反应，使反应液中溶解氧浓度下降，这样，氧电极就产生差异电流响应峰，由积分仪记录下来，当溶液中的尿酸经载流液洗脱离开酶反应后，电极很快回到起始状态，信号随即回到基线，就可以进行第二次注射分析。

3 伏安法

伏安法是目前常用的检测尿酸的方法，近年来，伏安法检测尿酸在理论研究和实际运用于临床诊断上都取得了很大的发展。伏安法检测尿酸常用的方法有以下几种：

3．1 微电极差示脉冲伏安法

在电极表面修饰一层化学物质分子，赋予电极以特定的性质，能有效地降低某些氧化原物质的过电位，从而达到分离或同时测定的目的。目前，微电极差示脉冲伏安法常用的是聚甘氨酸修饰碳纤维微电极差示脉冲伏安法，利用碳纤维微电极(CFME)经过特定的电化学方法活化l 0l，活化后的CFME表面修饰一层聚甘氨酸膜，该膜电极对尿酸有近可逆的响应，借助于差示脉冲伏安法(DPV)技术，它检测尿酸的灵敏度达2x10 mol／L，检测线性范围为3．3 x 10～～8．0x 10 mol／L(t=70s)。该方法测定结果准确，可望用于在线检测，但应用不是十分广泛。

3．2 吸附溶出伏安法

吸附溶出伏安法是一种高灵敏度，有一定选择性的电分析方法。它是在Britton—Robinson缓冲体系中(PH7．50)，研究尿酸的吸附溶出伏安行为，是测定尿酸的新方法。其实验方法是在电解池中加入Britton—Robinson缓冲液(PH7．50)和适量的尿酸溶液，定溶后通氮气除氧气5min，插入三电极系统，选择合适的富集时间，在+0．10～一0．80 V范围内用SV一1型溶出伏安仪记录其伏安曲线，这是一种新的测定尿酸的方法，可用于尿酸及血浆中的尿酸分析。此方法的线性范围为2．0 X 10一。～1．0 X10—5 ／L，检出限量为1．0×10—8 mol／L[ ，该法抗干扰能力强，操作简便，样品处理简单，易于推广。

4 高效液相色谱法

该方法是较常用，较基本的尿酸检测方法，所用流动相简单，分离效果较好，操作简便、快速。它的操作主要要注意以下几点：1．标准对照品及样品的制备与全处理：1)标准对照品制备：将尿酸用11．0mmol／L的混合标准溶液sl，将sl倍比稀释5次至。2)样本收集：收集受试者24h尿液，用甲苯防腐，准确记录尿量，混匀后取约5ml，同时取静脉血3ml，及时分离血清，与尿液一起置于一20℃下，于一周内分析。3)准确吸取系列混合标准液，血清及40倍稀释的尿液0．1ml，滴加1．9ml甲醇在漩涡振荡器上混匀，于60~r／min离心10min，取上清液1．2ml置于干净试管中，在氮气流下吹干，分析前以流动相0．3ml 复溶，漩混lmin，自动进样40ul进行色谱分析。2．色谱条件：分析柱：Shim—pack CLC 一0D6 15crI广_0．6ern预柱Shim—packCLC G—ODS(4)；流动相0．02mol／L KH2 PO4。3．用磷酸调PH 3．2；流速lml／min，柱温35℃AUFS 0、001；波长233nm

5 磷钨酸还原法

磷钨酸还原法是目前临床比较常用的方法，利用无蛋白滤液中的尿酸在碱性环境中可被磷钨酸氧化成尿囊素及二氧化碳，磷钨酸被还原成钨蓝(tungsten blue)，根据钨蓝颜色深浅，用710nm波长滤光板或红色滤片，与同样处理的标准比较，进行比色，以空白调零点，可求出其浓度值。其反应式如下：