水体DNA提取实验方法

水体DNA提取实验方法

1.取200ml 样品经0.22μm 的微孔滤膜过滤,将滤膜及过滤物在无菌条件下剪成1-2mm 的碎屑,放入Eppendorf 管中,加STET 缓冲液至满管,离心5分钟;

2.小心去上清,向沉淀中加入1mL STET 缓冲液洗涤, 10000rpm 离心2min收集沉淀;

3.用200μL STET 缓冲液重悬沉淀,将4μL 50mg/mL 的溶菌酶加到悬液中,室温放置(37℃)5min,然后置94℃水浴保温2min;

5. 加入SDS 至终浓度为0.5%(10μL)和蛋白酶K 至终浓度为

100μg/mL(1μL、20mg/ml),混合后置37℃水浴保温1h;

6. 加入NaCl 溶液(20μL、5mol/L)至终浓度为0.5mol/L,充分混匀,再加入25μL 5% CTAB(十六烷基三乙基溴化铵),混合并置65℃水浴保温10min;

7. 加入等体积(260μL,具体视情况而定)的饱和酚,混匀, 12000rpm 离心

5min,将上清液转入另一洁净的 1.5mL Eppendorf 管中;

8. 加入等体积酚/氯仿(V/V),混匀,12000rpm 离心5min,将上清液转入另一洁净的1.5mL Eppendorf 管中;

9. 加入0.6倍异丙醇混匀,在4℃或者-20℃(老师建议4℃)放置(沉淀)1h 或过夜;

10. 12000rpm 离心20min,小心吸出或者倒出异丙醇;

11. 用500μL 70%冷乙醇洗涤沉淀,12000rpm 离心5min 收集沉淀;

12. 小心吸出或者倒出乙醇,然后在吸水纸上倒置使残余乙醇流尽,空气干燥10-15 min,以便表面乙醇挥发,注意不要使沉淀完全干燥;

13. 加入30μL无菌双蒸水(ddH2O),用微量移液器吹吸,混合至DNA 充分溶解;

14. 将DNA 溶液存放于-20℃,不可使用自动除霜冰箱,以避免DNA 反复冻融;

药品准备

1. STET 缓冲液:8%蔗糖,50mM Tris(pH 8.0),50mM EDTA,0.1% Tween-20;

2. 50mg/mL 溶菌酶;蛋白酶K

3. 10% SDS;5mol/L NaCl;5% CTAB(十六烷基三乙基溴化铵);