产胞外淀粉酶极端嗜盐古菌CY的16S rRNA基因的克隆、测序及系统发育分析
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ｒＮ Ｒ Ａ基 因进 行 克 隆 和 测 序 ， 进 行 同 源 性 比 对 ， 果 显 示 ， 并 结 Ｃ Ｙ属 于 ａ ｒｂｌ 通 过 同 源 性 比 对 ， 克 隆 菌 株 Ｃ 的 Ｈ ｌ ｏｒｍ。 ｏ ｚ 对 Ｙ １ＳｒＮ ６ Ｒ Ａ基 因进 行 了系 统 发 育 分 析 。
１ 材 料 与 方 法 １ １ 供 试 菌 种 ．
１３ 胞 外淀 粉 酶检 测 ．
登 录 Ｎ Ｂ （ｔ ：／ ｗ ｎｂ． ｌ ｎｈ ｇｖ 网站 ， Ｃ Ｉｈｔ ／ ｗ ｗ．ｃｉｎｍ．ｉ．ｏ ） ｐ 将测 序 结果输入到 Ｂａｔ ｌｓ软件进行 １Ｓｒ Ｎ ６ Ｒ Ａ基因同源性 比对。
古菌 （ ｒｈｅ ） Ａ ｃａａ 是一类与 细菌及真核生 物显著 不同 的生
包好 ， 倒置 ，Ｏ℃培养 ２周后以卢戈 氏碘 液喷洒固体平板 ， ４ 显
色 、 察 、 相。 观 照
１ ４ Ｐ Ｒ 扩增 引物 序 列 ． Ｃ
命 的第三种形式 ， 多生活在极端或特殊环境中 ， 大 主要包括产
采 用 Ｆｅｅ ｃ ｒ ｒ ｋ的 Ｃ Ａ ｄｉ Ｔ Ｂ法提 取 Ｃ 菌 株 基 因组 Ｄ Ａ 。 Ｙ Ｎ
Ｐ Ｒ扩增程序为 ：５℃预变性 ５ｍｉ；４℃ ３ ， Ｃ ９ ｎ９ ０ｓ循环 ３ Ｏ次 ； ４ Ｃ １ｍ ｎ ７ ５ｏ ｉ； ２℃ ３ ｍ ｎ ７ ｉ ；２℃ 终 延 伸 １ ｉ （ ５ ｍ ｎ 西安 天 隆
Ｈ ｌ ｏｒｍ 属 。 ａ ｒｂｕ ｏ
关键词 ：淀粉 酶 ； 嗜盐古菌 ；１Ｓｒ Ｎ ６ Ｒ Ａ基 因 ； 克隆 ；系统发育
中 图分 类 号 ：Ｑ ３ ． ９９９ 文 献标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ２—１０ （０ ０ Ｏ — ０ ２— ２ １０ ３２ ２ １ ） １ ０ ６ ０
陈绍兴 代 平 李 沁 陈 ， ， ， 娅 ‘钱 丽 芳 谢 志雄 沈 ， ， ， 萍
（． １ 红河学院生命科学与技术学院 ， 云南蒙 自６ １０ ２ 武汉大学生命科学学院 ， ６ １０； ． 湖北武汉 ４ ０ ７ ） ３ ０ ２
摘要 ： 云南 省一平浪盐矿采集盐矿样品 ， 从 采用丰 富的嗜盐培养 基富集 ， 平板划线分 离 ， 粉平板检测 ， 淀 分离到 １ 株产胞外淀粉酶 的极端 嗜盐古菌 ， 暂时命名 为 Ｃ 。采用通 用 的引物 ， Ｙ 对其 １ Ｓｒ Ｎ ６ Ｒ Ａ基 因进行 Ｐ Ｒ扩增 、 Ｃ 克隆 和测 序 ， 对 １ Ｓｒ Ｎ 并 ６ Ａ基 因序列进 行 系统 进化 分析 ， １Ｓｒ Ｎ Ｒ 从 ６ Ｒ Ａ基 因序列 的同源 性 比对发 现 Ｃ Ｙ菌 株属 于 嗜盐古 菌
株 １Ｓｒ Ｎ ６ Ａ基 因序列扩增 ， Ｒ 具体引物参照文献 ［ ］ ８。
１５ Ｄ Ａ提 取 、Ｃ 扩 增及 产 物 回收 ． Ｎ ＰＲ
２％ ， ５ 在饱 和浓度盐溶液 中仍能生长 。极端 嗜盐 古菌生活 于盐湖 、 盐田及 盐腌制 品的表 面 ， 当盐 浓度低 于 １％ 时则不 ０ 能正常生长 。本研究从云南 省一平浪 盐矿采集盐矿样 品 ， 采用 嗜盐 的淀粉丰富 培养基进 行嗜盐 菌筛选 ， 中分离到 １ 从 株产胞外淀 粉酶 的 嗜盐古 菌 菌株 ， 命名 为 Ｃ 暂 Ｙ。对 其 １ Ｓ ６
一
６ ２一
平， 李
江苏农业科学
２１ ０ ０年第 １ 期
陈绍兴， 代
沁， 等．产胞外淀粉酶极端嗜盐古菌 Ｃ Ｙ的 １ＳｒＮ ６ Ａ基因的克隆、 Ｒ 测序及系统发育分析［ ］ Ｊ ．江苏农业科学， ｌ（ ）６ ６ Ｚ Ｏ１ ： Ｏ ２— ４
产胞外 淀粉酶极端 嗜盐古菌 Ｃ Ｙ的 １ＳｒＮ ６ Ａ Ｒ 基 因的克 隆、 测序及 系统发育分析
１ ８ 同源性 比对 分 析 ．
嗜盐液体培养基配方及 配制方法参 见文献 ［ ］ ７ ；嗜盐 淀
粉平板配方 与制作 同上 ， 添加 ２ 但 ％琼脂 粉 和 １ ％可 溶性 淀
粉 ；Ｂ培 养 基 成 分 为 蛋 白胨 １ ／ ， 母 粉 ５ ｓＬ Ｎ Ｃ Ｌ ＯｇＬ 酵 ／ ， ａ１ ５ｓ Ｌ １×１ Ｐ ２ ／ 。 ０ ａ１０℃消 毒 １ ｉ； ５ｍｎ 温度 降到 ６ ７ ５～ ０℃ 时， 倒 平 板 ， 制 作 氨 苄 青 霉 素 平 板 ， 加 入 终 浓 度 为 若 则 １０ ｇ 的氨苄青霉素。 ０ ／ 嗜盐培养基每瓶倒 １ 块平板 ， 每块 直径 ９ ｍ培养皿倒入培养基 ３ ， ０ｍ ０ｍＬ 弃不溶物 。
甲烷古菌 、 极端 嗜盐 古菌 和极端 嗜热古菌 等 ３大 类 。Ｊ 。嗜 盐菌是指在高盐浓度条件 下生 长的细菌 ， 在盐浓度为 １％ ５
一
采 用 大 肠 杆 菌 １Ｓｒ Ｎ 基 因 扩 增 通 用 引 物 进 行 Ｃ ６ Ｒ Ａ Ｙ菌
３ ％ 的 介 质 中 能 良好 生 长 ， 适 生 长 盐 浓 度 为 ２ ％ 一 ０ 最 ０
Ｄ Ｃ 。 采 用 ＴＡ Ｇ Ｎ 琼 脂 糖 凝 胶 Ｄ Ａ 回 收 试 剂 盒 回 收 Ｔ） ＩＮ Ｅ Ｎ Ｐ Ｒ 扩增 产 物 ， 收程 序 参 照 试 剂 盒 的使 用 说 明书 。 Ｃ 回
１６ Ｔ载体 克 隆及 蓝 白斑 筛选 ．
采用 Ｃ Ｃ： ａ １ 法制作 Ｄ ５ｔ Ｈ ｏ感受态细胞 ， 采用 Ｔ Ｋ Ｒ 公 ａａ ａ
１７ ． 质粒 提 取
嗜盐古菌菌株 Ｃ Ｙ采 集于 云南 省一 平浪盐矿 ， 河学 院 红 生理生化实验室分离保存 ； 大肠杆菌 Ｄ ５ ｔ Ｈ ｏ 菌株 由武汉 大
学 沈萍 教 授 赠 送 。 １２ 培 养 基 ．
随机挑取 白色菌斑进 行 Ｃ Ｙ菌株 质粒提取 ， 以琼 脂糖凝
胶 进 行 电泳 检 测 。
司 的 ｐ 一１Ｔ 载 体 （ ａ ａ ａＣｄ １ １ 进 行 １ ＳｒＮ ＭＤ ８ ＴＫ Ｒ ｏｅＤ ０ Ａ） ６ Ｒ Ａ 基 因克隆 ， 克隆程序依照 Ｔ载体的使用说 明；连接 、 转化产物
涂布于准备好的含有 ＩＴ Ｐ Ｇ和 Ｘ—Ｇ ｌ ａ 的氨苄 青霉素 平板上
进行筛选 。
１ 材 料 与 方 法 １ １ 供 试 菌 种 ．
１３ 胞 外淀 粉 酶检 测 ．
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古菌 （ ｒｈｅ ） Ａ ｃａａ 是一类与 细菌及真核生 物显著 不同 的生
包好 ， 倒置 ，Ｏ℃培养 ２周后以卢戈 氏碘 液喷洒固体平板 ， ４ 显
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１ ４ Ｐ Ｒ 扩增 引物 序 列 ． Ｃ
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Ｈ ｌ ｏｒｍ 属 。 ａ ｒｂｕ ｏ
关键词 ：淀粉 酶 ； 嗜盐古菌 ；１Ｓｒ Ｎ ６ Ｒ Ａ基 因 ； 克隆 ；系统发育
中 图分 类 号 ：Ｑ ３ ． ９９９ 文 献标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ２—１０ （０ ０ Ｏ — ０ ２— ２ １０ ３２ ２ １ ） １ ０ ６ ０
陈绍兴 代 平 李 沁 陈 ， ， ， 娅 ‘钱 丽 芳 谢 志雄 沈 ， ， ， 萍
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摘要 ： 云南 省一平浪盐矿采集盐矿样品 ， 从 采用丰 富的嗜盐培养 基富集 ， 平板划线分 离 ， 粉平板检测 ， 淀 分离到 １ 株产胞外淀粉酶 的极端 嗜盐古菌 ， 暂时命名 为 Ｃ 。采用通 用 的引物 ， Ｙ 对其 １ Ｓｒ Ｎ ６ Ｒ Ａ基 因进行 Ｐ Ｒ扩增 、 Ｃ 克隆 和测 序 ， 对 １ Ｓｒ Ｎ 并 ６ Ａ基 因序列进 行 系统 进化 分析 ， １Ｓｒ Ｎ Ｒ 从 ６ Ｒ Ａ基 因序列 的同源 性 比对发 现 Ｃ Ｙ菌 株属 于 嗜盐古 菌
株 １Ｓｒ Ｎ ６ Ａ基 因序列扩增 ， Ｒ 具体引物参照文献 ［ ］ ８。
１５ Ｄ Ａ提 取 、Ｃ 扩 增及 产 物 回收 ． Ｎ ＰＲ
２％ ， ５ 在饱 和浓度盐溶液 中仍能生长 。极端 嗜盐 古菌生活 于盐湖 、 盐田及 盐腌制 品的表 面 ， 当盐 浓度低 于 １％ 时则不 ０ 能正常生长 。本研究从云南 省一平浪 盐矿采集盐矿样 品 ， 采用 嗜盐 的淀粉丰富 培养基进 行嗜盐 菌筛选 ， 中分离到 １ 从 株产胞外淀 粉酶 的 嗜盐古 菌 菌株 ， 命名 为 Ｃ 暂 Ｙ。对 其 １ Ｓ ６
一
６ ２一
平， 李
江苏农业科学
２１ ０ ０年第 １ 期
陈绍兴， 代
沁， 等．产胞外淀粉酶极端嗜盐古菌 Ｃ Ｙ的 １ＳｒＮ ６ Ａ基因的克隆、 Ｒ 测序及系统发育分析［ ］ Ｊ ．江苏农业科学， ｌ（ ）６ ６ Ｚ Ｏ１ ： Ｏ ２— ４
产胞外 淀粉酶极端 嗜盐古菌 Ｃ Ｙ的 １ＳｒＮ ６ Ａ Ｒ 基 因的克 隆、 测序及 系统发育分析
１ ８ 同源性 比对 分 析 ．
嗜盐液体培养基配方及 配制方法参 见文献 ［ ］ ７ ；嗜盐 淀
粉平板配方 与制作 同上 ， 添加 ２ 但 ％琼脂 粉 和 １ ％可 溶性 淀
粉 ；Ｂ培 养 基 成 分 为 蛋 白胨 １ ／ ， 母 粉 ５ ｓＬ Ｎ Ｃ Ｌ ＯｇＬ 酵 ／ ， ａ１ ５ｓ Ｌ １×１ Ｐ ２ ／ 。 ０ ａ１０℃消 毒 １ ｉ； ５ｍｎ 温度 降到 ６ ７ ５～ ０℃ 时， 倒 平 板 ， 制 作 氨 苄 青 霉 素 平 板 ， 加 入 终 浓 度 为 若 则 １０ ｇ 的氨苄青霉素。 ０ ／ 嗜盐培养基每瓶倒 １ 块平板 ， 每块 直径 ９ ｍ培养皿倒入培养基 ３ ， ０ｍ ０ｍＬ 弃不溶物 。
甲烷古菌 、 极端 嗜盐 古菌 和极端 嗜热古菌 等 ３大 类 。Ｊ 。嗜 盐菌是指在高盐浓度条件 下生 长的细菌 ， 在盐浓度为 １％ ５
一
采 用 大 肠 杆 菌 １Ｓｒ Ｎ 基 因 扩 增 通 用 引 物 进 行 Ｃ ６ Ｒ Ａ Ｙ菌
３ ％ 的 介 质 中 能 良好 生 长 ， 适 生 长 盐 浓 度 为 ２ ％ 一 ０ 最 ０
Ｄ Ｃ 。 采 用 ＴＡ Ｇ Ｎ 琼 脂 糖 凝 胶 Ｄ Ａ 回 收 试 剂 盒 回 收 Ｔ） ＩＮ Ｅ Ｎ Ｐ Ｒ 扩增 产 物 ， 收程 序 参 照 试 剂 盒 的使 用 说 明书 。 Ｃ 回
１６ Ｔ载体 克 隆及 蓝 白斑 筛选 ．
采用 Ｃ Ｃ： ａ １ 法制作 Ｄ ５ｔ Ｈ ｏ感受态细胞 ， 采用 Ｔ Ｋ Ｒ 公 ａａ ａ
１７ ． 质粒 提 取
嗜盐古菌菌株 Ｃ Ｙ采 集于 云南 省一 平浪盐矿 ， 河学 院 红 生理生化实验室分离保存 ； 大肠杆菌 Ｄ ５ ｔ Ｈ ｏ 菌株 由武汉 大
学 沈萍 教 授 赠 送 。 １２ 培 养 基 ．
随机挑取 白色菌斑进 行 Ｃ Ｙ菌株 质粒提取 ， 以琼 脂糖凝
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司 的 ｐ 一１Ｔ 载 体 （ ａ ａ ａＣｄ １ １ 进 行 １ ＳｒＮ ＭＤ ８ ＴＫ Ｒ ｏｅＤ ０ Ａ） ６ Ｒ Ａ 基 因克隆 ， 克隆程序依照 Ｔ载体的使用说 明；连接 、 转化产物
涂布于准备好的含有 ＩＴ Ｐ Ｇ和 Ｘ—Ｇ ｌ ａ 的氨苄 青霉素 平板上
进行筛选 。