蛋白质分子结构
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
14
测定步骤 A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
蛋 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的 白 关系，即可确定多肽链的数目。 质 G G S S 一 S S 级 S S S S 结 G D 构 Mr相同，N－末端相同 Mr相同，N－末端不同 的 测 Mr不同，N－末端相同 Mr不同，N－末端不同 定
25
丹磺酰氯法
末 端 基 氨 基 酸 测 定
N (C H 3 ) 2 R + H 2N CH O C
N (C H 3 ) 2
多肽N-端 S O 2C l 丹磺酰氯 水解 + R SO2 HN CH O C OH 氨基酸 N (C H 3 ) 2 SO2 HN
R CH
O C
丹磺酰N-端氨基酸
丹磺酰氨基酸
O C NH CH R3
O C NH CH R4
O C
水解位点
肽链
胃 蛋 白 酶
Pepsin：R1和R2＝ Phe, Trp, Tyr; Leu 以及其它疏水性氨 基酸水解速度较快。 R1=Pro 水解受抑。
36
O NH CH R1 C NH CH R2
O C NH CH R3
O C NH CH R4
Rn CH
O C OH
N-端氨基酸
+
C-端氨基酸 R O C N H N H 2 + H 2N Rn CH O C OH
H
N H 2N H 2
H 2N
CH
氨基酸酰肼
（其余的氨基酸则变成肼化物）
C-端氨基酸
28
氨肽酶(amino peptidases)法
ห้องสมุดไป่ตู้
末 端 基 氨 基 酸 测 定
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出 的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基 酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋 白质的N-末端残基顺序。
最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以 亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。
29
羧肽酶(Carboxypeptidase)法
羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-
末 端 基 氨 基 酸 测 定
端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶
水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道 蛋白质的C-末端残基顺序。
四级结构(Quaternary Structure, 4o Structure)
5
6
7
8
9
蛋白质的结构
蛋白质是由一条或多条肽链以特殊方式结合而
成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子
量在10,000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
蛋白质分子量变化范围很大, 从大约10,000到
H 2N
CH
N-端氨基酸 R O C OH +
DNP衍生物
O 2N H 2O
HN N O2
CH
氨基酸
DNP-氨基酸
24
丹磺酰氯法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘 磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基 作用，得到丹磺酰-氨基酸。
末 端 基 氨 基 酸 测 定
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的 荧光性质，检测灵敏度可以达到1109mol。
O C NH CH R3
O C NH CH R4
O C
水解位点
Peptide Chain
糜 或胰凝乳蛋白酶 蛋 （Chymotrypsin）： 白 酶 R1=Phe, Trp,Tyr时
水解快; R1= Leu，Met 和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑。
35
O NH CH R1 C NH CH R2
33
O NH CH R1 C NH CH R2
O C NH CH R3
O C NH CH R4
O C
水解位点
肽链
胰 蛋 白 酶
Trypsin：R1=Lys和Arg侧链 （专一性较强，水解速度 快）。R2=Pro 水解受抑。
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-
R1
R1:Lys/Arg
R2
34
O NH CH R1 C NH CH R2
它重新被氧化。
18
可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的
非共价力；应用过甲酸氧化法(反应见教材p79)拆
分多肽链间的二硫键。
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
多肽链链间二硫键的断裂方法: HCOOOH SO3 s ①8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理→H -巯 基乙醇处理→烷基化试剂处理. SO3H s ②用过甲酸氧化法
拆分借助非共价键连接的几条多肽链,用8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍处理.
17
C.二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起。
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，
用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二
硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂
（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止
测定末端氨基酸残基的摩尔数可确定多肽链的数目。
15
B.多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必
蛋 白 须先进行拆分。 质 一 级 结 构 的 测 定
16
多肽链的拆分
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
由几条多肽链借助非共价键连接在一 起，称为寡聚蛋白质(Oligomeric proteins), 如，血红蛋白(Hb)为四聚体，烯醇化酶为二 聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理， 即可分开多肽链(亚基,subunit).
12
（1）测定蛋白质一级结构的要求 a、样品必需纯（>97%以上）； b、知道蛋白质的分子质量； c、知道蛋白质由几条多肽链（几个亚基， Subunit）组成；
13
(2) 一级结构测定的步骤 ⑴ 测N末端数目，确定几条肽链 ⑵ 拆肽链、分离肽链（如果具有四级结构的话） ⑶ 各肽链水解，测各肽链Aa分子摩尔比 ⑷ 测肽链的N、C末端的Aa种类 ⑸ 部分水解成大小不等的肽片段，分离之 ⑹ 测每个肽片段的AA顺序 ⑺ 部分水解（另一套酶或条件）成肽片段，分离 之 ⑻ 测每个肽片段的Aa顺序 ⑼ 比较 ⑹, ⑻拼凑成完整protein seqence(顺序) ⑽ 测定原protein中二硫键及酰胺基位臵
3
结合蛋白conjugated protein
由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。
色蛋白(Chromoprotein)：由简单蛋白与色素物质 结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 糖蛋白（Glycoprotein）：由简单蛋白与糖类物 质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白（Lipoprotein）：由简单蛋白与脂类结合 而成。 如血清-，-脂蛋白等。 核蛋白(Nucleoprotein)：由简单蛋白与核酸结合 而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。 黄素蛋白(Flavoprotein)：由简单蛋白与黄素核 苷酸结合而成。如琥珀酸脱氢酶 金属蛋白（Metalloprotein）：由简单蛋白与金 属结合而成。如铁蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶 （硒）、乙醇氧化酶 （锌） 4
3.3.2 Molecular structure of proteins
蛋白质的结构层次有四级
p72
一级结构 (Primary Structure, 1o Structure)
二级结构 (Secondary Structure, 2o Structure)
三级结构(Tertiary Structure , 3o Structure)
常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰
脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。
羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末 端残基的肽键。
30
31
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或 多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成 两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离 开来。
O C
谷 氨 酸 蛋 白 酶 和 精 氨 酸 蛋 白 酶
NH
CH R1
C
水解位点
肽链
谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓 冲液); R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓 冲液) 精氨酸蛋白酶： R1=Arg
作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。
在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基
酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同
的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。
23
二硝基氟苯（DNFB）法
末 端 基 氨 基 酸 测 定
R O 2N F N O2 DNFB H
+ +
O C O 2N HN N O2
R CH
O C
3.3.1 Classification of proteins
一、 依据蛋白质的外形分类
p71
按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤 维状蛋白质。 球状蛋白质：globular protein外形接近球 形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶， 大多数蛋白质属于这一类。 纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤 维。又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶 性纤维状蛋白质。
多肽链断裂法：酶解法和化学法
32
酶解法:
多 肽 链 的 选 择 性 降 解
胰蛋白酶(Trypsin)
糜蛋白酶,也叫胰凝乳蛋白酶 (Chymotrypsin) 胃蛋白酶(Pepsin)
嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)
羧肽酶(Carboxypeptidase)
氨肽酶(Aminopeptidase)
1
二、依据蛋白质的组成分类
按照蛋白质的组成，可以分为
简单蛋白(simple protein) 结合蛋白(conjugated protein) 。
2
简单蛋白simple protein
又称为单纯蛋白质,仅由氨基酸组成的肽链，不含其它 成分。 1.清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存 在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水， 易溶于稀酸中。 2.谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物 蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于 70－80％乙醇中。 3.精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在于细胞核中。 4.硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织 中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。
O C
水解位点
肽链
嗜 热 菌 蛋 白 酶
Thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的 氨基酸水解速度较快。 R2=Pro或Gly 水解受抑。 R1或R3=Pro 水解受抑。
37
O
O NH CH R2 C NH CH R3
O C NH CH R4
19
巯 基 （ ） 的 保 护
-
O C H 2O C C l
-
-SH
OOC
C HC H2 SO C C H2 N H3
+
O
C H 2C l
-
OOC
C HC H2 SH N H3
+
O IC H 2 C N H 2
OOC
C HC H2 S C H2 N H3
+
-
OOC
C H C H 2 S C H 2C N H 2 N H3
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基
酸和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是 N-端氨基酸分析法。
22
二硝基氟苯（DNFB）法又叫Sanger法
Sanger法。2,4-二硝基氟苯（DNFB）在
末 端 基 氨 基 酸 测 定
OH_条件下，能够与肽链N-端的游离氨基
+
O
作用：这些反应可用于巯基的保护。
20
S S S
S S S
胰岛素 Insulin
SH
SH SH
HO-CH2-CH2-SH(打开二硫键) SH SH SH ICH2COOH(保护)
SCH2C00H SCH2C00H
SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H
21
D. 分析多肽链的N-末端和C-末端
26
肼解法
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。
末 端 基 氨 基 酸 测 定
多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基
酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸
则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩
合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分
离。
27
肼解法
末 端 基 氨 基 酸 测 定
R H 2N CH
O C HN
R n-1 O CH C HN
1,000,000道尔顿甚至更大。
10
一、蛋白质的一级结构 1. 定义
1969年，国际纯化学与
应用化学委员会（IUPAC）
规定：蛋白质的一级结构
指蛋白质多肽连中AA的
排列顺序，包括二硫键的 位臵。其中最重要的是多
肽链的氨基酸顺序，它是
蛋白质生物功能的基础。
11
2.蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化 学研究的基础。自从1953年F.Sanger测 定了胰岛素的一级结构以来，现在已经 有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
测定步骤 A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
蛋 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的 白 关系，即可确定多肽链的数目。 质 G G S S 一 S S 级 S S S S 结 G D 构 Mr相同，N－末端相同 Mr相同，N－末端不同 的 测 Mr不同，N－末端相同 Mr不同，N－末端不同 定
25
丹磺酰氯法
末 端 基 氨 基 酸 测 定
N (C H 3 ) 2 R + H 2N CH O C
N (C H 3 ) 2
多肽N-端 S O 2C l 丹磺酰氯 水解 + R SO2 HN CH O C OH 氨基酸 N (C H 3 ) 2 SO2 HN
R CH
O C
丹磺酰N-端氨基酸
丹磺酰氨基酸
O C NH CH R3
O C NH CH R4
O C
水解位点
肽链
胃 蛋 白 酶
Pepsin：R1和R2＝ Phe, Trp, Tyr; Leu 以及其它疏水性氨 基酸水解速度较快。 R1=Pro 水解受抑。
36
O NH CH R1 C NH CH R2
O C NH CH R3
O C NH CH R4
Rn CH
O C OH
N-端氨基酸
+
C-端氨基酸 R O C N H N H 2 + H 2N Rn CH O C OH
H
N H 2N H 2
H 2N
CH
氨基酸酰肼
（其余的氨基酸则变成肼化物）
C-端氨基酸
28
氨肽酶(amino peptidases)法
ห้องสมุดไป่ตู้
末 端 基 氨 基 酸 测 定
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出 的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基 酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋 白质的N-末端残基顺序。
最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以 亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。
29
羧肽酶(Carboxypeptidase)法
羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-
末 端 基 氨 基 酸 测 定
端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶
水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道 蛋白质的C-末端残基顺序。
四级结构(Quaternary Structure, 4o Structure)
5
6
7
8
9
蛋白质的结构
蛋白质是由一条或多条肽链以特殊方式结合而
成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子
量在10,000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
蛋白质分子量变化范围很大, 从大约10,000到
H 2N
CH
N-端氨基酸 R O C OH +
DNP衍生物
O 2N H 2O
HN N O2
CH
氨基酸
DNP-氨基酸
24
丹磺酰氯法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘 磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基 作用，得到丹磺酰-氨基酸。
末 端 基 氨 基 酸 测 定
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的 荧光性质，检测灵敏度可以达到1109mol。
O C NH CH R3
O C NH CH R4
O C
水解位点
Peptide Chain
糜 或胰凝乳蛋白酶 蛋 （Chymotrypsin）： 白 酶 R1=Phe, Trp,Tyr时
水解快; R1= Leu，Met 和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑。
35
O NH CH R1 C NH CH R2
33
O NH CH R1 C NH CH R2
O C NH CH R3
O C NH CH R4
O C
水解位点
肽链
胰 蛋 白 酶
Trypsin：R1=Lys和Arg侧链 （专一性较强，水解速度 快）。R2=Pro 水解受抑。
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-
R1
R1:Lys/Arg
R2
34
O NH CH R1 C NH CH R2
它重新被氧化。
18
可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的
非共价力；应用过甲酸氧化法(反应见教材p79)拆
分多肽链间的二硫键。
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
多肽链链间二硫键的断裂方法: HCOOOH SO3 s ①8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理→H -巯 基乙醇处理→烷基化试剂处理. SO3H s ②用过甲酸氧化法
拆分借助非共价键连接的几条多肽链,用8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍处理.
17
C.二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起。
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，
用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二
硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂
（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止
测定末端氨基酸残基的摩尔数可确定多肽链的数目。
15
B.多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必
蛋 白 须先进行拆分。 质 一 级 结 构 的 测 定
16
多肽链的拆分
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
由几条多肽链借助非共价键连接在一 起，称为寡聚蛋白质(Oligomeric proteins), 如，血红蛋白(Hb)为四聚体，烯醇化酶为二 聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理， 即可分开多肽链(亚基,subunit).
12
（1）测定蛋白质一级结构的要求 a、样品必需纯（>97%以上）； b、知道蛋白质的分子质量； c、知道蛋白质由几条多肽链（几个亚基， Subunit）组成；
13
(2) 一级结构测定的步骤 ⑴ 测N末端数目，确定几条肽链 ⑵ 拆肽链、分离肽链（如果具有四级结构的话） ⑶ 各肽链水解，测各肽链Aa分子摩尔比 ⑷ 测肽链的N、C末端的Aa种类 ⑸ 部分水解成大小不等的肽片段，分离之 ⑹ 测每个肽片段的AA顺序 ⑺ 部分水解（另一套酶或条件）成肽片段，分离 之 ⑻ 测每个肽片段的Aa顺序 ⑼ 比较 ⑹, ⑻拼凑成完整protein seqence(顺序) ⑽ 测定原protein中二硫键及酰胺基位臵
3
结合蛋白conjugated protein
由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。
色蛋白(Chromoprotein)：由简单蛋白与色素物质 结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 糖蛋白（Glycoprotein）：由简单蛋白与糖类物 质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白（Lipoprotein）：由简单蛋白与脂类结合 而成。 如血清-，-脂蛋白等。 核蛋白(Nucleoprotein)：由简单蛋白与核酸结合 而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。 黄素蛋白(Flavoprotein)：由简单蛋白与黄素核 苷酸结合而成。如琥珀酸脱氢酶 金属蛋白（Metalloprotein）：由简单蛋白与金 属结合而成。如铁蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶 （硒）、乙醇氧化酶 （锌） 4
3.3.2 Molecular structure of proteins
蛋白质的结构层次有四级
p72
一级结构 (Primary Structure, 1o Structure)
二级结构 (Secondary Structure, 2o Structure)
三级结构(Tertiary Structure , 3o Structure)
常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰
脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。
羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末 端残基的肽键。
30
31
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或 多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成 两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离 开来。
O C
谷 氨 酸 蛋 白 酶 和 精 氨 酸 蛋 白 酶
NH
CH R1
C
水解位点
肽链
谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓 冲液); R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓 冲液) 精氨酸蛋白酶： R1=Arg
作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。
在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基
酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同
的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。
23
二硝基氟苯（DNFB）法
末 端 基 氨 基 酸 测 定
R O 2N F N O2 DNFB H
+ +
O C O 2N HN N O2
R CH
O C
3.3.1 Classification of proteins
一、 依据蛋白质的外形分类
p71
按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤 维状蛋白质。 球状蛋白质：globular protein外形接近球 形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶， 大多数蛋白质属于这一类。 纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤 维。又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶 性纤维状蛋白质。
多肽链断裂法：酶解法和化学法
32
酶解法:
多 肽 链 的 选 择 性 降 解
胰蛋白酶(Trypsin)
糜蛋白酶,也叫胰凝乳蛋白酶 (Chymotrypsin) 胃蛋白酶(Pepsin)
嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)
羧肽酶(Carboxypeptidase)
氨肽酶(Aminopeptidase)
1
二、依据蛋白质的组成分类
按照蛋白质的组成，可以分为
简单蛋白(simple protein) 结合蛋白(conjugated protein) 。
2
简单蛋白simple protein
又称为单纯蛋白质,仅由氨基酸组成的肽链，不含其它 成分。 1.清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存 在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水， 易溶于稀酸中。 2.谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物 蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于 70－80％乙醇中。 3.精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在于细胞核中。 4.硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织 中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。
O C
水解位点
肽链
嗜 热 菌 蛋 白 酶
Thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的 氨基酸水解速度较快。 R2=Pro或Gly 水解受抑。 R1或R3=Pro 水解受抑。
37
O
O NH CH R2 C NH CH R3
O C NH CH R4
19
巯 基 （ ） 的 保 护
-
O C H 2O C C l
-
-SH
OOC
C HC H2 SO C C H2 N H3
+
O
C H 2C l
-
OOC
C HC H2 SH N H3
+
O IC H 2 C N H 2
OOC
C HC H2 S C H2 N H3
+
-
OOC
C H C H 2 S C H 2C N H 2 N H3
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基
酸和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是 N-端氨基酸分析法。
22
二硝基氟苯（DNFB）法又叫Sanger法
Sanger法。2,4-二硝基氟苯（DNFB）在
末 端 基 氨 基 酸 测 定
OH_条件下，能够与肽链N-端的游离氨基
+
O
作用：这些反应可用于巯基的保护。
20
S S S
S S S
胰岛素 Insulin
SH
SH SH
HO-CH2-CH2-SH(打开二硫键) SH SH SH ICH2COOH(保护)
SCH2C00H SCH2C00H
SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H
21
D. 分析多肽链的N-末端和C-末端
26
肼解法
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。
末 端 基 氨 基 酸 测 定
多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基
酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸
则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩
合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分
离。
27
肼解法
末 端 基 氨 基 酸 测 定
R H 2N CH
O C HN
R n-1 O CH C HN
1,000,000道尔顿甚至更大。
10
一、蛋白质的一级结构 1. 定义
1969年，国际纯化学与
应用化学委员会（IUPAC）
规定：蛋白质的一级结构
指蛋白质多肽连中AA的
排列顺序，包括二硫键的 位臵。其中最重要的是多
肽链的氨基酸顺序，它是
蛋白质生物功能的基础。
11
2.蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化 学研究的基础。自从1953年F.Sanger测 定了胰岛素的一级结构以来，现在已经 有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。