流式细胞凋亡分析(PPT文档)

细胞凋亡的特征
形态学特征：
光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特 征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆 皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤 为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细 胞核双链DNA发生裂解所致。
细胞凋亡的特征
形态学特征：
DNA降解后，形成长度主要为180200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多有 膜包被的小体，称为凋亡小体（apoptotic bodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引 起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡 细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到 凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。
生化特征：
2 核酸内切酶的激活：
细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激 活，将核小体间连接DNA降解，形成长度主 要为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组 蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也 不改变。在DNA凝胶电泳分析中呈现出特征 性“梯状”条带，而细胞坏死时，DNA片断 大小不一，无“梯状”条带出现。但并非 所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化 特征。
流式细胞凋亡分析
概念
细胞凋亡（apoptosis）是指有核细 胞在一定条件下通过启动其内部自身机制， 主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发 生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控 制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体 中一种普遍存在的现象。
概念
细胞凋亡是维持人体正常生理过程和 功能活动所必需的，是多细胞生物生命活 动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以 存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。
细胞凋亡的特征
生化特征： 2 核酸内切酶的激活：
细胞凋亡的特征
生化特征：
3 线粒体的变化：
线粒体发生的重要改变之一就是凋亡 诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型 通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中， 线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体 膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶 联。
细胞凋亡的特征
细胞凋亡的特征
形态学特征：
电镜下，细胞核内可见高电子密度区， 这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体后， 在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。 染色质聚集区以外的低电子密度区为透明 区，是由于核孔变大导致其通透性增加， 细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增 殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细 胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得 致密、紊乱。
Fra Baidu bibliotek 细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重 要作用。它具有一段携带活化位点的保守 氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬 氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具 有相同的结构和功能特性而被称为caspase。
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
caspase可能在凋亡细胞的形态变化中 起了主导作用。Caspase通常是以酶原形式 存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化 为有活性的酶，活化的caspase进一步激活 其他的caspase前体，形成了级联放大切割 过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。
生化特征：
3 线粒体的变化：
线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡 的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧 质子和其他离子分布不对称造成的。线粒 体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切 相关的bcl-2家族分布在细胞内膜系统，其 中线粒体外膜上分布最多，bcl-2具有抑制 线粒体通透性变化的能力，并通过此途径 抑制细胞凋亡。
细胞凋亡的特征
形态学特征：
细胞凋亡的特征
形态学特征：
细胞凋亡的特征
形态学特征：
共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位 和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细 胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰 丝氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血 酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细 胞的清除有关。
概念
细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是 细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区 别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大 剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过 程，并可导致周围组织的炎症反应。
概念
细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：
清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞；
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
目前已发现15个caspase家族成员，分 别命名为caspase-1～15，并根据其功能特 点分成两类，即启动caspase(caspase-2、 8、9、10）和效应caspase(caspase3、6、 7）。
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
启动caspase作用于凋亡信号触发后上 游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬 肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解 细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这 两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行 凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位 点的进程。
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为 17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活化 的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他 caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18， CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3切割 CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期 指示因子。
细胞凋亡的特征
细胞凋亡的特征
形态学特征：
凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提 取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱， 可见清晰的DNA〝梯子〞(ladder)。
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
细胞凋亡的发生和发展过程也可能是 水解酶级联切割的过程，它将大分子结构 的物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子 碎片，致使细胞发生凋亡。
细胞凋亡的特征
生化特征：
4 胞质Ca2+和pH的变化：
细胞内Ca2+和H+浓度的稳定对维持生命 活动至关重要。胞内Ca2+库的释放，胞质 Ca2+与细胞凋亡关系密切。胞外Ca2+内流促 使胞质Ca2+持续升高，作为凋亡信号启动凋 亡发生。
细胞凋亡的特征
生化特征：
4 胞质Ca2+和pH的变化：
此外，Ca2+的释放打破了细胞内结构的 稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分 开始和细胞结构正常时不能接触到的基质 接触，从而触发细胞凋亡。