南华大学 生物化学第14章基因重组与基因工程
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3´
5´
5´
3´
5´ 5´ 5´3´ 3´ ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA
片段重组体：
3´
5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´
切开的链与原来断裂的
是同一条链，重组体含有 一段异源双链区，其两侧 来自同一亲本DNA。
5´
拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的 链，重组体异源双链区的
异位点之间发生的整合。
例 ：（一）λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特 异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特 异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序 列(long terminal repeat, LTR)。
例（二）细菌的特异位点重组 鼠伤寒沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变
①
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶
定 义 : 限 制 性 核 酸 内 切 酶 (restriction
endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识
别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重 组体DNA。
3´ 5´ 5´ 3´ 内切酶 3´ 5´ (recBCD) 3´ 5´ ①两个同源染色体DNA排列整齐
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
②一个DNA的一条链断裂、并 与另一个DNA对应的链连接， 形成Holliday中间体 DNA侵扰 (recA)
第十四章
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic
Engineering
DNA重组（DNA recombination）:
是指DNA片段在细胞内,细胞间,甚至在不同物种之间进 行交换,交换后的片段仍然具有复制和表达的功能.
基因工程 (genetic engineering)
3´
3´
5´
5´
两侧来自不同亲本DNA。
5´
5´3´
3´
二、细菌的基因转移与重组有四种方式
接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 细胞融合 (cell fusion)
（一）接合作用(conjugation) 当细胞与细胞、或细菌之间通过菌毛相互接触 时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞 （细菌）的DNA转移称为接合作用。
一、重组DNA技术相关概念 （一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
克隆可以在DNA分子水平、细胞水平、植物 或动物整体水平进行。
DNA克隆（DNA cloning）：
应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA
次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受
体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
即通过噬菌体将细菌基因从供体细胞转移到受
体细胞的过程. 例： 噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
例：λ噬菌体感染宿主伴随基因转移
基因工程—— 实现基因克隆所用的方法及相关
的工作称基因工程，又称重组DNA技术、重组DNA
工艺学。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
基因工程的应用: ① 分离获得某一感兴趣的基因 ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
由转座子介导的转座
第二节 重组DNA技术
重组DNA技术的发展史：
1865年 GJ Mendel的豌豆杂交试验. 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验. 1967年 世界上5个实验室发现了DNA连接酶. 1970年 Smith在微生物中发现限制性内切酶。Temin和 Baltimore发现逆转录酶。 1973年 美国Paul Berg和DA Jackson构建第一个重组DNA分子. 1977年 美国建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组 DNA技术制造医学上重要的药物。 1981年 转基因小鼠问世。 1982年 应用重组DNA技术生产的胰岛素经美国FDA批准上市。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉.
3´ 5´ 5´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´ 内切酶(RuvC)
Holiday中间体
3´ 5´ 内切酶(RuvC)
3´ 5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 3´ 3´ 5´ 3´
5´
5´ DNA连接酶
5´ 3´
5´ DNA连接酶
3´
5´
3´
3´ 5´ 拼 接 重 组 体
片 段 重 组 体
5´ 3´
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G + GATCC CCTAG G
分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的 Holliday模型(1964年由Holliday R提出)。
Holliday模型中，同源重组主要有4个关键步骤：
①两个同源染色体DNA排列整齐。 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应 的链连接，形成Holliday中间体。 ③通过分支移动产生异源双链DNA。
转 座 重组(transpositional recombination)
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
发生在同源序列之间的重组称为同源重组，它
通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列
间进行单链或双链片段的交换。是最基本的DNA重 组方式，因此又称基本重组。 同源重组不需要特异的DNA序列,而是依赖 于两分子之间序列的相似性.
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 DNA 启动序列 启动序列 I H1
hin
H2
H2鞭毛素
Hin重组酶 阻遏蛋白 H2 I H1
hin
转位片段
H1鞭毛素
例（三）免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重 链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其 中两个编码轻链(和)，一个编码重链。
是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组,并将重组 后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程.
第一节
自然界的DNA重组
自然界中，不同物种或个体之间经常发生DNA重组和基因 转移，它是基因变异、物种演变和生物进化的基础。
基因重组的分类：
同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组(site-specific recombination)
（一）插入序列转座
插入序列(insertion sequence, IS)的组成： 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列;
一个转座酶（transposase)编码基因.
IR
Transposase Gene
IR
发生形式： 保守性转座 复制性转座
插 入 序 列 的 复 制 性 转 座
需要 ATP 和 Mg2+ 存在。
同尾酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相
同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同
尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
（二）转座子转座
转座子(transposons) ——可从一个染色体位
点转移到另一位点分散的重复序列。
转座子组成：
IR
两个反向重复序列（分布在转座酶及其它抗
性基因的两侧）；
转座酶编码基因；
抗生素抗性等有用的基因。
Transposase Gene 有用基因 IR
转座子与插入序列的相同点: 都含两个反向重复序列及转座酶 基因。区别: 转座子含有抗生素抗性等有用的编码基因.
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G +GATCC CCTAG G
BstⅠ GGATCC CCTAGG
GATCC G + G CCTAG
DNA连接酶
1967年世界上5个实验室同时发现了DNA连接酶。 T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一
双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ-5ˊ磷酸二酯键，将具 有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。
识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
①
Klenow片段
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
间插DNA V片段 RSS
单链切开
RSS
RAG1 RAG2
J片段
OH OH
分子内转酯反应
单链切开 转移核苷酸 修复、连接
V
J
四、转座重组（transpositional recombination）
由插入序列和转座子介导的基因移位或
重排称为转座(transposition)。
（一）插入序列转座
（二）转座子转座
接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子
(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有 目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。 不同来源的DNA可以是：同源的或异源的、原核的或真 核的、天然的或人工合成的DNA。
号序列(recombination signal sequence, RSS)。
此 重 排 的 重 组 酶 基 因 rag (recombination activating gene) 共 有 两 个 ， 分 别 产 生 蛋 白 质 RAG1和RAG2。
免 疫 球 蛋 白 基 因 重 排 过 程
（四）细胞融合
在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合
导致的基因转移和重组。
在实验条件下，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽
聚糖而成为原生质体，可人工促进原生质体的融
合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。
三、位点特异重组(site-specific recombination)
定义：由整合酶催化，在两个DNA序列的特
轻链的基因片段：
L V J C
重链的基因片段：
L V D J C
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC GTGTCCAC TGTTTTTGG
基因片段 重组信号序列
重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的 V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J 片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信
质粒 ——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子.
可接合质粒如F因子(细菌性鞭毛蛋白编码基因)
（二）转化作用(transformation)
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使
细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型， 称为转化作用。
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
ห้องสมุดไป่ตู้ （三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再
5´ 3´ 3´ 5´ 内切酶 (recBCD) 5´ 3´ 3´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
分支迁移 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
DNA 连接酶
Holiday中间体
③通过分支移动产生异源双链DNA
5´ 3´ 3´ 5´
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同功异源酶:来源不同的限制酶，但能识别 和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。
5´
5´
3´
5´ 5´ 5´3´ 3´ ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA
片段重组体：
3´
5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´
切开的链与原来断裂的
是同一条链，重组体含有 一段异源双链区，其两侧 来自同一亲本DNA。
5´
拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的 链，重组体异源双链区的
异位点之间发生的整合。
例 ：（一）λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特 异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特 异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序 列(long terminal repeat, LTR)。
例（二）细菌的特异位点重组 鼠伤寒沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变
①
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶
定 义 : 限 制 性 核 酸 内 切 酶 (restriction
endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识
别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重 组体DNA。
3´ 5´ 5´ 3´ 内切酶 3´ 5´ (recBCD) 3´ 5´ ①两个同源染色体DNA排列整齐
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
②一个DNA的一条链断裂、并 与另一个DNA对应的链连接， 形成Holliday中间体 DNA侵扰 (recA)
第十四章
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic
Engineering
DNA重组（DNA recombination）:
是指DNA片段在细胞内,细胞间,甚至在不同物种之间进 行交换,交换后的片段仍然具有复制和表达的功能.
基因工程 (genetic engineering)
3´
3´
5´
5´
两侧来自不同亲本DNA。
5´
5´3´
3´
二、细菌的基因转移与重组有四种方式
接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 细胞融合 (cell fusion)
（一）接合作用(conjugation) 当细胞与细胞、或细菌之间通过菌毛相互接触 时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞 （细菌）的DNA转移称为接合作用。
一、重组DNA技术相关概念 （一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
克隆可以在DNA分子水平、细胞水平、植物 或动物整体水平进行。
DNA克隆（DNA cloning）：
应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA
次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受
体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
即通过噬菌体将细菌基因从供体细胞转移到受
体细胞的过程. 例： 噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
例：λ噬菌体感染宿主伴随基因转移
基因工程—— 实现基因克隆所用的方法及相关
的工作称基因工程，又称重组DNA技术、重组DNA
工艺学。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
基因工程的应用: ① 分离获得某一感兴趣的基因 ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
由转座子介导的转座
第二节 重组DNA技术
重组DNA技术的发展史：
1865年 GJ Mendel的豌豆杂交试验. 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验. 1967年 世界上5个实验室发现了DNA连接酶. 1970年 Smith在微生物中发现限制性内切酶。Temin和 Baltimore发现逆转录酶。 1973年 美国Paul Berg和DA Jackson构建第一个重组DNA分子. 1977年 美国建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组 DNA技术制造医学上重要的药物。 1981年 转基因小鼠问世。 1982年 应用重组DNA技术生产的胰岛素经美国FDA批准上市。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉.
3´ 5´ 5´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´ 内切酶(RuvC)
Holiday中间体
3´ 5´ 内切酶(RuvC)
3´ 5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 3´ 3´ 5´ 3´
5´
5´ DNA连接酶
5´ 3´
5´ DNA连接酶
3´
5´
3´
3´ 5´ 拼 接 重 组 体
片 段 重 组 体
5´ 3´
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G + GATCC CCTAG G
分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的 Holliday模型(1964年由Holliday R提出)。
Holliday模型中，同源重组主要有4个关键步骤：
①两个同源染色体DNA排列整齐。 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应 的链连接，形成Holliday中间体。 ③通过分支移动产生异源双链DNA。
转 座 重组(transpositional recombination)
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
发生在同源序列之间的重组称为同源重组，它
通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列
间进行单链或双链片段的交换。是最基本的DNA重 组方式，因此又称基本重组。 同源重组不需要特异的DNA序列,而是依赖 于两分子之间序列的相似性.
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 DNA 启动序列 启动序列 I H1
hin
H2
H2鞭毛素
Hin重组酶 阻遏蛋白 H2 I H1
hin
转位片段
H1鞭毛素
例（三）免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重 链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其 中两个编码轻链(和)，一个编码重链。
是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组,并将重组 后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程.
第一节
自然界的DNA重组
自然界中，不同物种或个体之间经常发生DNA重组和基因 转移，它是基因变异、物种演变和生物进化的基础。
基因重组的分类：
同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组(site-specific recombination)
（一）插入序列转座
插入序列(insertion sequence, IS)的组成： 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列;
一个转座酶（transposase)编码基因.
IR
Transposase Gene
IR
发生形式： 保守性转座 复制性转座
插 入 序 列 的 复 制 性 转 座
需要 ATP 和 Mg2+ 存在。
同尾酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相
同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同
尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
（二）转座子转座
转座子(transposons) ——可从一个染色体位
点转移到另一位点分散的重复序列。
转座子组成：
IR
两个反向重复序列（分布在转座酶及其它抗
性基因的两侧）；
转座酶编码基因；
抗生素抗性等有用的基因。
Transposase Gene 有用基因 IR
转座子与插入序列的相同点: 都含两个反向重复序列及转座酶 基因。区别: 转座子含有抗生素抗性等有用的编码基因.
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G +GATCC CCTAG G
BstⅠ GGATCC CCTAGG
GATCC G + G CCTAG
DNA连接酶
1967年世界上5个实验室同时发现了DNA连接酶。 T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一
双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ-5ˊ磷酸二酯键，将具 有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。
识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
①
Klenow片段
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
间插DNA V片段 RSS
单链切开
RSS
RAG1 RAG2
J片段
OH OH
分子内转酯反应
单链切开 转移核苷酸 修复、连接
V
J
四、转座重组（transpositional recombination）
由插入序列和转座子介导的基因移位或
重排称为转座(transposition)。
（一）插入序列转座
（二）转座子转座
接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子
(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有 目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。 不同来源的DNA可以是：同源的或异源的、原核的或真 核的、天然的或人工合成的DNA。
号序列(recombination signal sequence, RSS)。
此 重 排 的 重 组 酶 基 因 rag (recombination activating gene) 共 有 两 个 ， 分 别 产 生 蛋 白 质 RAG1和RAG2。
免 疫 球 蛋 白 基 因 重 排 过 程
（四）细胞融合
在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合
导致的基因转移和重组。
在实验条件下，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽
聚糖而成为原生质体，可人工促进原生质体的融
合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。
三、位点特异重组(site-specific recombination)
定义：由整合酶催化，在两个DNA序列的特
轻链的基因片段：
L V J C
重链的基因片段：
L V D J C
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC GTGTCCAC TGTTTTTGG
基因片段 重组信号序列
重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的 V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J 片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信
质粒 ——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子.
可接合质粒如F因子(细菌性鞭毛蛋白编码基因)
（二）转化作用(transformation)
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使
细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型， 称为转化作用。
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
ห้องสมุดไป่ตู้ （三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再
5´ 3´ 3´ 5´ 内切酶 (recBCD) 5´ 3´ 3´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
分支迁移 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
DNA 连接酶
Holiday中间体
③通过分支移动产生异源双链DNA
5´ 3´ 3´ 5´
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同功异源酶:来源不同的限制酶，但能识别 和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。